本发明涉及生物组织样本整体染色、三维成像领域，具体涉及一种基于dil超声染色生物组织样本三维成像方法。
背景技术：
dil细胞膜红色荧光探针(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanineperchlorate)；dii的分子式为c59h97cln2o4，分子量为933.88是最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现橙红色荧光，最大激发波长549nm，最大发射波长565nm。dil在细胞膜外呈现弱的荧光特性，与细胞膜或者单位膜结合后则呈现很强的荧光特性，并可沿着单位膜做侧向扩散，逐渐使整个细胞的细胞膜被染色。它的荧光强而稳定，不影响被标记细胞的存活和生长，在标记细胞内消失慢，因此可以作为一种独特细胞膜(单位膜)标记物。作为神经科学研究领域中常用的荧光示踪剂，可以清晰揭露神经元精细的形态结构，如胞体、轴突、树突及树突棘等，dil除了最简单的细胞膜荧光标记外，还可以用于检测细胞的融合和粘附，检测发育或移植过程中细胞迁移、检测细胞毒性和标记脂蛋白。
dil作为细胞膜荧光示踪剂的缺点：
dil不足之处是染色扩散速度较慢，在活体的扩散速度平均为每天4～6mm，而在固定的脑组织中扩散速度仅为每天400μm，一般最大扩散距离仅10～12mm，因此dil很难对整体生物组织样品进行快速的标记。
传统石蜡切片的缺点：
传统的石蜡切片后染色不仅效果不佳，还存在损失，轴向分辨率低，很难对切片再次进行三维重构，不能确保整体组织的完整性。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于dil超声染色生物组织样本三维成像方法；该方法利用dil染料能与膜结合后呈现很强的荧光特性，及其超声加热渗透的方法，对生物组织器官进行整体染色，利用tdi～fmost成像对生物样本整体染色，连续切片断层成像的方法，其中的染色方法可以清晰的显示器官内部细胞层面立体的效果，具有快速、经济、高质量的特点。
为实现上述目的，本发明所设计一种基于dil超声染色生物组织样本三维成像方法，包括以下步骤：
1)向小鼠心脏灌注后取出小肠；然后将小肠组织置于质量分数为3～5％的多聚甲醛溶液中固定6～24h；
2)用0.05～0.2m的pbs缓冲液对固定后的小肠组织进行漂洗20～60min；漂洗2～4次；
3)将小肠组织分别置于不同体积分数的乙醇溶液中进行脱水；
4)然后将脱水的小肠组织置于无水乙醇配置浓度0.1～0.3ug/mldil工作液中，在超声条件下进行超声处理；
5)将小肠组织置于无水乙醇中超声漂洗，重复2～4次；
6)将小肠组织置于二甲苯透明1～3次，每次0.5～2h；
7)将石蜡块放在真空泵加热到65～70℃，经双层滤纸过滤，将透明好的小组织浸在过滤后的石蜡中3～5h，抽真，然后进行缓慢降温；
8)将制作好的石蜡包埋样品置于在0.05～0.2m的pbs缓冲液水槽中，利用tdi～fmost相机进行采集(水镜成像)。
进一步地，所述步骤1)中，多聚甲醛溶液的质量分数为4％，固定时间12h。
再进一步地，所述步骤2)中，pbs缓冲液的浓度为0.1m，漂洗时间为30min；漂洗3次。
再进一步地，所述步骤3)中，将小肠依次置于体积分数为50％、75％、95％的乙醇溶液中，脱水1h。
再进一步地，所述步骤4)中，超声波的功率密度为1.00w/cm2～1.50w/cm2,频率为28khz～43khz；超声处理的时间为1～3h。
再进一步地，所述步骤4)中，超声波的功率密度为1.50w/cm2,频率为35khz；超声处理的时间为2h。
再进一步地，所述步骤5)中，超声波的功率密度为1.00w/cm2～1.50w/cm2,频率为28khz～43khz；超声处理的时间为1～3h
再进一步地，所述步骤5)中，超声波的功率密度为1.50w/cm2,频率为35khz；超声处理的时间为2h。
上述dil染料工作液配制：
购置10mgdil染料(产品编号：c1063上海碧云天生物技术有限公司)，用无水乙醇配置成1mg/ml的储存液于-20℃避光保存，配置10ml,10ug/ml的工作液，
本发明的有益效果：
1)本发明利用无水乙醇配置dil染料的工作液，既能达到溶解dil的效果，又能在超声震荡的过程中对组织样本进行脱水；
2)本发明针对dil染色扩散速度较慢，很难实现生物组织大样本的整体染色的缺陷；本发明借助超声加热的方式(间隔式超声，避免持续超声过程中样本的龟裂)将dil染料快速的渗透到组织内部，从而实现脏器组织大样本的整体染色；
3)本发明针对传统的石蜡切片制作过程切片、裱片、成像、数据质量无保障(手工切片、数据易损、难配准)，只能获得低轴向分辨率的成像结果的缺陷；本发明借助tdi-fmost(荧光显微光学断层成像仪)对石蜡包埋的样品进行边切削，边用pbs漂洗，边采集的方法实现对整体dil染色石蜡样品进行成像；从而获取1-10μm一层整体小肠三维结构图。
附图说明
图1为本发明实施提供的小鼠小肠精细切面图；
图2为本发明实施提供的小鼠小肠连续切面图，2μm一层；
图3为提供的小鼠小肠的立体三视图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
基于dil超声染色生物组织样本三维成像方法，包括以下步骤：
1)向小鼠心脏灌注后取出小肠；然后将小肠组织置于质量分数为4％的多聚甲醛溶液中固定12h；
2)用0.1m的pbs缓冲液对固定后的小肠组织进行漂洗30min；漂洗3次；
3)将小肠组织分别置于体积分数为50％、75％、95％的乙醇溶液中，分别脱水1h；
4)然后将脱水的小肠组织置于无水乙醇配置浓度0.2μg/mldil工作液中，在在功率密度为1.00w/cm2～1.50w/cm2,频率为28khz～43khz条件下进行超声处理1～3h；
5)将小肠组织置于无水乙醇中在功率密度为1.00w/cm2～1.50w/cm2,频率为28khz～43khz条件下超声漂洗1～3h，重复2～4次；
6)将小肠组织置于二甲苯，透明2次，每次1h；
7)将石蜡块放在真空泵加热到65～70℃，经双层滤纸过滤，将透明好的小组织浸在过滤后的石蜡中3～5h，抽真，然后进行缓慢降温；
8)将制作好的石蜡包埋样品置于在0.05～0.2m的pbs缓冲液水槽中，利用tdi～fmost相机进行采集(水镜成像)。
如图1～3所示：借助tdi-fmost(荧光显微光学断层成像仪)对石蜡包埋的样品进行边切削，边用pbs漂洗，边采集的方法实现对整体dil染色石蜡样品进行成像；从而获取1-10μm一层整体小肠三维结构图。
实施例2
基于dil超声染色生物组织样本三维成像方法，包括以下步骤：
1)向小鼠心脏灌注后取出小肠；然后将小肠组织置于质量分数为3％的多聚甲醛溶液中固定24h；
2)用0.2m的pbs缓冲液对固定后的小肠组织进行漂洗20min；漂洗4次；
3)将小肠组织分别置于体积分数为50％、75％、95％的乙醇溶液中，分别脱水1h；
4)然后将脱水的小肠组织置于无水乙醇配置浓度0.3ug/mldil工作液中，在功率密度为1.00w/cm2，频率为43khz条件下进行超声处理1h；
5)将小肠组织置于无水乙醇中在功率密度为1.00w/cm2,频率为43khz条件下超声漂洗1h，重复4次；
6)将小肠组织置于二甲苯，透明3次，每次0.5h；
7)将石蜡块放在真空泵加热到70℃，经双层滤纸过滤，将透明好的小组织浸在过滤后的石蜡中3h，抽真，然后进行缓慢降温；
8)将制作好的石蜡包埋样品置于在0.2m的pbs缓冲液水槽中，利用tdi～fmost相机进行采集(水镜成像)。
实施例3
基于dil超声染色生物组织样本三维成像方法，包括以下步骤：
1)向小鼠心脏灌注后取出小肠；然后将小肠组织置于质量分数为5％的多聚甲醛溶液中固定6h；
2)用0.05m的pbs缓冲液对固定后的小肠组织进行漂洗60min；漂洗2次；
3)将小肠组织分别置于体积分数为50％、75％、95％的乙醇溶液中，分别脱水1h；
4)然后将脱水的小肠组织置于无水乙醇配置浓度0.1ug/mldil工作液中，在功率密度为1.50w/cm2w/cm2,频率为28khz条件下进行超声处理3h；
5)将小肠组织置于无水乙醇中在功率密度为1.50w/cm2,频率为28khz条件下超声漂洗1h，重复2次；
6)将小肠组织置于二甲苯，透明1次，每次2h；
7)将石蜡块放在真空泵加热到65℃，经双层滤纸过滤，将透明好的小组织浸在过滤后的石蜡中5h，抽真，然后进行缓慢降温；
8)将制作好的石蜡包埋样品置于在0.05m的pbs缓冲液水槽中，利用tdi～fmost相机进行采集(水镜成像)。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
1.一种基于dil超声染色生物组织样本三维成像方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)向小鼠心脏灌注后取出小肠；然后将小肠组织置于质量分数为3～5％的多聚甲醛溶液中固定6～24h；
2)用0.05～0.2m的pbs缓冲液对固定后的小肠组织进行漂洗20～60min；漂洗2～4次；
3)将小肠组织分别置于不同体积分数的乙醇溶液中进行脱水；
4)然后将脱水的小肠组织置于无水乙醇配置浓度0.1～0.3μg/mldil工作液中，在超声条件下进行超声处理；
5)将小肠组织置于无水乙醇中超声漂洗，重复2～4次；
6)将小肠组织置于二甲苯，透明1～3次，每次0.5～2h；
7)将石蜡块放在真空泵加热到65～70℃，经双层滤纸过滤，将透明好的小组织浸在过滤后的石蜡中3～5h，抽真，然后进行缓慢降温；
8)将制作好的石蜡包埋样品置于在0.05～0.2m的pbs缓冲液水槽中，利用tdi～fmost相机进行采集。
2.根据权利要求1所述基于dil超声染色生物组织样本三维成像方法，其特征在于：所述步骤1)中，多聚甲醛溶液的质量分数为4％，固定时间12h。
3.根据权利要求1所述基于dil超声染色生物组织样本三维成像方法，其特征在于：所述步骤2)中，pbs缓冲液的浓度为0.1m，漂洗时间为30min；漂洗3次。
4.根据权利要求1所述基于dil超声染色生物组织样本三维成像方法，其特征在于：所述步骤3)中，将小肠依次置于体积分数为50％、75％、95％的乙醇溶液中，脱水1h。
5.根据权利要求1所述基于dil超声染色生物组织样本三维成像方法，其特征在于：所述步骤4)中，超声波的功率密度为1.00w/cm2～1.50w/cm2,频率为28khz～43khz；超声处理的时间为1～3h。
6.根据权利要求5所述基于dil超声染色生物组织样本三维成像方法，其特征在于：所述步骤4)中，超声波的功率密度为1.50w/cm2,频率为35khz；超声处理的时间为2h。
7.根据权利要求1所述基于dil超声染色生物组织样本三维成像方法，其特征在于：所述步骤5)中，超声波的功率密度为1.00w/cm2～1.50w/cm2,频率为28khz～43khz；超声处理的时间为1～3h。
8.根据权利要求1所述基于dil超声染色生物组织样本三维成像方法，其特征在于：所述步骤5)中，超声波的功率密度为1.50w/cm2,频率为35khz；超声处理的时间为2h。
技术总结