本发明涉及一种血管模型。
背景技术：
近年来，进行利用包括具有微米级宽度的被称为微通道的装置，模仿例如血管、肠道、肝脏及肺等内脏器官的尝试。美国专利申请公开(us)第2011/0053207号、日本专利申请公开(jp-b)第5415538号及jp-b第5815643号例如均公开了一种内脏器官模型，其包括具有在其表面具有细胞层的多孔膜及被多孔膜隔开的至少两个微通道。
例如能够利用在us第2011/0053207号、jp-b第5415538号及jp-b第5815643号中公开的内脏器官模型来进行各种试验和测试。例如，使包含药物的血液在一微通道流通，之后测量通过多孔膜从一微通道移动至另一微通道的红血球、生物标志物等的个数或量，由此可进行所谓的渗漏测试。通过该渗漏测试，能够进行设置于多孔膜的表面的细胞层的药物性损伤程度的评价，并能够进行药物毒理学测试。
然而，常规内脏器官模型中使用的多孔膜上的孔利用已知的径迹蚀刻工序来制作，在该工序中例如对构成多孔膜的材料照射重离子。因此，膜上孔的开口覆盖率例如低至2％～20％，并且由于膜也厚，因此红血球等的通过受到多孔膜的阻碍。即，在常规内脏器官模型中，可能存在无法准确评价设置于多孔膜的表面的细胞层的药物性损伤程度的情况。
技术实现要素：
本发明提供一种血管模型，其抑制红血球等的移动在渗漏测试期间受到多孔膜的阻碍。
根据本发明的第一方式的血管模型包括：一对通道部件，彼此相对且各通道部件包含形成有各自的通道的相对面；及多孔膜，包括沿厚度方向贯穿的多个贯穿孔，配置于一对通道部件的相对面之间，将微通道之间隔开，其中，所述多孔膜具有血管内皮细胞层以覆盖与微通道中的一个相对的表面，所述贯穿孔的平均开口直径为1μm～20μm，贯穿孔的开口覆盖率为30％～70％。
在上述结构，将微通道之间隔开的多孔膜上的贯穿孔的平均开口直径为1μm～20μm，贯穿孔的开口覆盖率为30％～70％。因此，在渗漏测试期间，当红血球等流经多孔膜上的贯穿孔而从一微通道移动至另一微通道时，可以抑制红血球等的移动受到多孔膜的阻碍。
在本发明的第二方式中，在第一方式中，所述多孔膜的膜厚可以为贯穿孔的平均开口直径的一半以下。
在上述第二方式中，由于所述多孔膜的膜厚为贯穿孔的平均开口直径的一半以下，因此与多孔膜的膜厚大于贯穿孔的开口的平均开口直径的一半的情况相比，红血球等可以更易于通过多孔膜上的贯穿孔。因此，第二方式可进一步提高渗漏测试的准确度。
在本发明的第三方式中，在第一或第二方式中，将贯穿孔彼此连通的连通孔可形成于多孔膜的内侧；所述贯穿孔排列成蜂窝状；所述贯穿孔的开口直径的变异系数可以为10％以下；及所述多孔膜的孔隙率可以为50％以上。
在上述第三方式中，所述贯穿孔排列成蜂窝状并且通过所述连通孔彼此连通。所述贯穿孔的开口的开口直径的变异系数为10％以下，且多孔膜的孔隙率为50％以上。由此，在第三方式中，使红血球等更均匀地通过。因此，第三方式可进一步提高渗漏测试的准确度。
在本发明的第四方式，在第一至第三方式中，细胞层的细胞可选自包括平滑肌细胞、间充质干细胞、周细胞及成纤维细胞的组中，并且该细胞层可设置于与另一微通道相对的所述多孔膜的另一表面。
在上述第四方式中，由于将选自包括平滑肌细胞、间充质干细胞、周细胞及成纤维细胞的组中的细胞的细胞层形成于与形成有血管内皮细胞层的表面相反的一侧的多孔膜的另一表面，因此可实现更接近实际血管的血管模型。
在本发明的第五方式中，在第一方式至第四方式中，所述多孔膜的拉伸断裂伸长率可以为50％以上；及多孔膜的10％拉伸所需的应力可以为1000gf/mm2以下。
在上述第五方式中，由于多孔膜由具有50％以上的拉伸断裂伸长率且具有1000gf/mm2以下的10％拉伸所需的应力的挠性材料形成，因此可实现更接近实际血管的血管模型。
在本发明第六方式中，在第一方式至第五方式中，所述贯穿孔可具有俯视观察下的平面形状，且可包括长轴和短轴。
在上述第六方式中，由于贯穿孔在俯视观察下例如具有椭圆形等平面形状，因此红血球等更易于通过贯穿孔。因此，第六方式可进一步提高渗漏测试的准确度。
在本发明的第七方式中，在第一方式至第六方式中，所述多孔膜可以包括形成有贯穿孔的多孔区域及未形成有贯穿孔的无孔区域。
在上述第七方式中，例如由于配置于微通道的进口附近及出口附近的多孔膜的部分构成为未形成贯穿孔的无孔区域，因此可调节红血球等在微通道内的流动。因此，第七方式可进一步提高渗漏测试的准确度。
根据上述方式，本发明可以抑制红血球等的移动在渗漏测试期间受到多孔膜的限制。
附图说明
参考以下附图对本发明的例示性实施方式进行详细说明。
图1是表示例示性实施方式的血管模型的整体结构的立体图。
图2是表示例示性实施方式的血管模型的整体结构的分解立体图。
图3是表示例示性实施方式的血管模型的多孔膜的放大剖视图。
图4是表示例示性实施方式的血管模型的多孔膜的俯视图。
图5是表示变形例的血管模型的多孔膜的俯视图。
图6是表示变形例的血管模型的多孔膜的俯视图。
图7a是实施例1的多孔膜的显微照片。
图7b是比较例1的多孔膜的显微照片。
图8a是实施例3的细胞层粘附血管模型的微通道中的图像荧光结果。
图8b是比较例3的细胞层粘附血管模型的微通道中的图像荧光结果。
图9a是实施例3的细胞层粘附血管模型中的fitc-葡聚糖渗透性测试结果。
图9b是比较例3的细胞层粘附血管模型中的fitc-葡聚糖渗透性测试结果。
图10a是实施例4的多孔膜的显微照片。
图10b是图10a的局部放大图。
图11是实施例5的多孔膜的显微照片。
具体实施方式
以下，参考图1～图6对本发明的例示性实施方式的实施例及变形例进行说明。以下例示性实施方式仅为本发明的一例，并不限制本发明的范围。为了便于说明各种结构，附图中的各种结构的尺寸会适当变更。因此，附图的比例可以与实际操作中的比例不同。
如图1及图2所示，例示性实施方式的血管模型10包括彼此层叠的上层通道部件12及下层通道部件14。上层通道部件12及下层通道部件14例如由聚二甲基硅氧烷(pdms)等弹性材料构成，并且实际上具有矩形板形状。
除了pdms以外，构成上层通道部件12及下层通道部件14的材料的例子包括环烯烃聚合物(cop)、环氧树脂、聚氨酯树脂、苯乙烯系热塑性弹性体、烯烃系热塑性弹性体、丙烯酸系热塑性弹性体、聚乙烯醇等
规定上层微通道16的凹部18形成于上层通道部件12的下表面，即形成于与下层通道部件14相对的相对面12a。凹部18包括进口18a、出口18b及将进口18a与出口18b连通的通道部分18c。
贯穿孔20a及20b形成于上层通道部件12而在厚度方向贯穿上层通道部件12，并具有分别与进口18a及出口18b连通的下端。贯穿孔20a及20b的上端在上层通道部件12的上表面开口。供液管(未图示)与贯穿孔20a及20b的上端连接。
相同地，定义下层微通道22的凹部24形成于下层通道部件14的上表面，即形成于与上层通道部件12相对的相对面14a。凹部24包括进口24a、出口24b及将进口24a与出口24b连通的通道部分24c。
下层通道部件14的进口24a及出口24b和上层通道部件12的进口18a及出口18b设置于俯视观察下不重叠的位置。相对于此，下层通道部件14的通道部分24c及上层通道部件12的通道部分18c设置于俯视观察下重叠的位置。
贯穿孔26a及26b也形成于上层通道部件12，沿厚度方向贯穿上层通道部件12，并具有分别与进口24a及出口24b连通的下端。贯穿孔26a及26b的上端在上层通道部件12的上表面开口。供液管(未图示)与贯穿孔26a及26b的上端连接。
多孔膜28设置于上层通道部件12及下层通道部件14的相对面12a及14a之间。上层通道部件12及下层通道部件14以夹持在其间的状态与多孔膜28接合。除了用粘合剂粘合以外，例如可以将焊接、吸引力(自粘)或螺合等各种方法用作将上层通道部件12及下层通道部件14接合的方法。
多孔膜28例如是溶解于疏水性有机溶剂的疏水性聚合物。疏水性有机溶剂是在25℃水中具有10(g/100g水)以下的溶解度的液体。
疏水性聚合物的例子包括以下聚合物，例如聚丁二烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚酯(例如，聚乳酸、聚己内酯、聚乙醇酸，聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚乳酸-聚己内酯共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯、聚萘二甲酸乙二酯、聚乙二醇丁二酸酯、聚丁二酸丁二醇酯及聚-3-羟基丁酸酯)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺(polyacrylamine)、聚甲基丙烯酰胺、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚偏二氟乙烯、聚六氟丙烯、聚乙烯醚、聚乙烯咔唑、聚乙酸乙烯酯、聚四氟乙烯、聚内酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚氨酯、聚脲、多环芳烃(polyaromatics)、聚砜、聚醚砜、聚硅氧烷衍生物及纤维素酰化物(例如，三乙基纤维素、酸丙酸纤维素及乙酸丁酸纤维素)。从例如使用在日本专利第4,734,157中公开的制作方法来制作蜂窝膜的观点考虑，优选为溶解于疏水性有机溶剂的聚合物。
例如从溶剂中的溶解性、光学特性、电特性、膜强度及弹性的观点考虑，这些聚合物可根据需要具有均聚物、共聚物、共混聚合物或聚合物合金的形式。这些聚合物可以单独使用，也可以组合两种以上来使用。多孔膜28的材料并不限于疏水性聚合物，可根据细胞粘附性等观点来选择材料。
将多孔膜28的上表面28a及下表面28b(以下，可将上表面28a及下表面28b统称为“主表面”)设置成实际上覆盖上层微通道16及下层微通道22的通道部分18c及24c的尺寸，由此将上层微通道16与下层微通道22分隔。
具体而言，多孔膜28的上表面28a(即与上层通道部件12相对的主表面)与上层通道部件12的凹部18一起定义上层微通道16。多孔膜28的下表面28b(即与下层通道部件14相对的主表面)与下层通道部件14的凹部24一起定义下层微通道22。
如图3所示，例如在多孔膜28的上表面28a设置血管内皮细胞层36来完全覆盖上表面28a。由此，上在层微通道16的内部形成非常接近血管内部的环境。血管内皮细胞的例子包括：源自脐静脉、脐动脉、主动脉、冠状动脉、肺动脉、肺微血管或真皮微血管的血管内皮细胞；及从多能干细胞分化的血管内皮细胞。
细胞层38例如由选自包括平滑肌细胞、间充质干细胞、周细胞及成纤维细胞中的组中的细胞构成，并设置于多孔膜28的下表面28b而完全覆盖下表面28b。由此，下层微通道22形成非常接近血管外部的环境。间充质干细胞(msc)是能够分裂成肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞等的成体干细胞。
选自包括细胞平滑肌细胞、间充质干细胞、周细胞及成纤维细胞的组中的细胞的细胞层38可设置于多孔膜28的上表面28a，而血管内皮细胞层36可设置于多孔膜28的下表面28b。另外，血管内皮细胞层36设置于多孔膜28的一个主表面即可。可以为细胞层38未设置于多孔膜28的另一个主表面的结构。
从细胞粘附性的观点考虑，在多孔膜28的上表面28a及下表面28b中的至少一个接种细胞的区域优选为用选自包括纤连蛋白、胶原蛋白(例如，i型胶原蛋白、iv型胶原蛋白或v型胶原蛋白)、层粘连蛋白、玻连蛋白、明胶、基底膜蛋白聚糖、巢蛋白、蛋白聚糖、骨桥蛋白、生腱蛋白、肾连蛋白、基底膜基质及聚赖氨酸的组中的至少一种涂布。优选多孔膜28及后述贯穿孔30的内侧用它们中的至少一种涂布。
为了将血管内皮细胞层36及细胞层38分别设置于多孔膜28的主表面，例如可采用以下方法：将细胞悬浮液倒在上层微通道16及下层微通道22上以在多孔膜28的主表面接种细胞。而且，还可以采用以下方法：在单独的培养装置内的多孔膜28的主表面接种并培养细胞，之后将形成有血管内皮细胞层36及细胞层38的多孔膜28安装到血管模型10。
如图3及图4所示，沿厚度方向贯穿多孔膜28的多个贯穿孔30形成于多孔膜28。贯穿孔30的开口30a分别设置在多孔膜28的上表面28a及下表面28b。如图4所示，开口30a在俯视观察下为圆形。开口30a设置成彼此分开。平坦部32在相邻的开口30a之间延伸。开口30a并不限于圆形，也可以构成为多边形。
规则地排列多个开口30a，在本例示性实施方式中，如图4所示，例如排列成蜂窝状。蜂窝状排列是将开口30a的中心配置于以平行六边形(优选为正六边形)或与其相似的形状为单位的顶点位置及对角线交叉的点上的排列。其中，“开口的中心”表示俯视观察下的开口30a的中心。
开口30a的排列并不限于蜂窝状。开口30a也可以形成为格子状或面心格子状。格子状排列是将开口的中心配置于以平行四边形(当然包括正方形、长方形及菱形，优选为正方形)或与其相似的形状为单位的顶点位置的排列。面心格子状排列是将开口的中心配置于以平行四边形(当然包括正方形、长方形及菱形，优选为正方形)或与其相似的形状为单位的顶点位置及对角线交叉的点上的排列。
开口30a的排列可以是任意的。然而，从实现多孔膜28的上表面28a及下表面28b上的开口30a的均匀密度的观点考虑，优选规则地排列多个开口30a。规则地排列是该排列的平行六边形或平行四边形单位的表面积的变异系数例如为10％以下的排列。一些开口30a可以缺失或开口30a可以不用排列整齐。然而，开口30a优选在所有方向上无间断地连续排列。“变异系数”是将规定总体的标准偏差除以其平均值而得的值，并且是以％表示总体中的分散程度的指数。
如图3所示，多孔膜28上的各贯穿孔30具有球截形状，其为将球体的上端和下端截去的形状。彼此相邻的贯穿孔30通过多孔膜28的内部的各连通孔34彼此连通。
优选各贯穿孔30与所有相邻的贯穿孔30连通。如本例示性实施方式，在多个贯穿孔30的开口30a排列成蜂窝状的情况下，各贯穿孔30通过六个连通孔34与六个相邻的贯穿孔30连通。贯穿孔30可具有筒形、圆柱形、多边柱形等，连通孔34可以是将相邻的贯穿孔30连接的管状空孔。
贯穿孔30的各开口30a的开口直径d例如是血液中的红血球能够通过的尺寸。具体而言，平均开口直径优选为1μm～20μm，更优选为3μm～10μm。将平均开口直径设为1μm以上，贯穿孔30能够具有使红血球通过的尺寸，将平均开口直径设为20μm以下，能够使血管内皮细胞层36及细胞层38保持在多孔膜28的主表面上。
其中，“开口直径d”是开口30a的长轴，“平均开口直径”是对任选的10个以上的开口30a测量的开口直径d的计算平均值。“长轴”表示在开口的外轮廓上任意选择的两点之间的最长距离。然而，在方向被指定的情况下，“长轴”表示在该方向上任意选择的两点之间的最长距离。
贯穿孔30的开口30a的开口覆盖率优选为30％～70％，更优选为40％～60％。若将开口覆盖率设为30％以上，则能够抑制红血球的移动受到多孔膜28的阻碍，若将开口覆盖率设为70％以下，则能够实现多孔膜28所需的强度。
其中，“开口覆盖率”表示以％表示的s2:s1的比率，其中s1表示假定多孔膜28的主表面为平顺的情况下(即假定多孔膜28上不存在开口30a的情况下)的多孔膜28的单位表面积，s2表示每一单位表面积的开口30a的合计表面积，其中s1及s2使用了相同的测量单位。
多孔膜28的膜厚t优选为贯穿孔30的开口30a的平均开口直径的一半以下。具体而言，厚度t优选为0.5μm～10μm，更优选为1μm～10μm。若将多孔膜28的膜厚t设为贯穿孔30的平均开口直径的一半以下的厚度，则能够抑制红血球的移动受到多孔膜28的阻碍。
而且，由于多孔膜28是细胞粘附并生长的支架，因此随着多孔膜28上的开口覆盖率越高且多孔膜28的膜厚越薄，多孔膜28的一表面上的细胞与多孔膜28的另一表面上的细胞之间的细胞间相互作用即通过体液因子的信息传递或细胞间接触中的至少一种变得更加活跃。在细胞培养期间，用于在多孔膜28的主表面上设置血管内皮细胞层36及细胞层38的细胞间相互作用越活跃，越能够更好地制作出功能接近生物体内组织的血管模型。
开口30a的开口直径d的变异系数优选为10％以下，变异系数越小越优选。开口直径d的变异系数越小，红血球等越能够均匀地通过多孔膜28上的多个贯穿孔30。
多孔膜28的孔隙率优选为50％以上。将孔隙率设为50％以上，能够抑制红血球的移动受到多孔膜28的阻碍。若孔隙率过大，多孔膜28的强度相对于对其要求的强度变得不充分，因此孔隙率优选为95％以下。
其中，“孔隙率”表示以％表示的v2:v1的比率，其中v1表示假定多孔膜28的主表面平顺的情况下(即假定多孔膜28上不存在开口30a的情况下)的多孔膜28的单位体积，v2表示在每单位体积设置的贯穿孔30及连通孔34的合计体积，其中v1及v2使用了相同的测量单位。
多孔膜28的拉伸断裂伸长率优选为50％以上，更优选为100％，进一步优选为200％以上。多孔膜28的10％拉伸所需的应力优选为1000gf/mm2以下。随着拉伸断裂伸长率得到提高且10％拉伸所需的应力下降，材料变得更具有挠性。因此可以弯曲、拉伸并压缩多孔膜28而使血管模型10更接近实际血管。
其中，“拉伸断裂伸长率”能够通过根据jisk6251：2010中定义的方法来测量多孔膜28的拉伸断裂伸长率而进行评价。“10％拉伸所需的应力”能够通过根据jisk6251：2010中定义的方法来测量将多孔膜28拉伸10％时施加到多孔膜28的应力而进行评价。
形成有贯穿孔30的多孔膜28的制作方法的例子包括纳米印刷工序、冷凝工序、蚀刻工序、喷砂工序或压缩成型工序。纳米印刷工序是如下方法：贯穿孔30通过将用于构成多孔膜28的材料倒入具有凸部和凹部的模具或对构成多孔膜28的材料按压所述模具来制作。冷凝工序是如下方法：在构成多孔膜28的材料的表面诱导凝结，由此将水滴作为模具来形成贯穿孔30。
相较于其他方法，冷凝工序能够使多孔膜28的膜厚更薄，并能够提高开口30a的孔隙率和开口覆盖率，还能够在多孔膜28内设置连通孔34。因此，在本例示性实施方式中，利用冷凝工序来制作多孔膜28。冷凝工序例如在jp-b第4945281号、jp-b第5422230号、jp-b第5405374号及日本专利申请公开(jp-a)第2011-74140号中有详细记载。
接着，作为一例，对使用本例示性实施方式的血管模型10来进行药物毒理学评价的情况进行说明。当实施药物毒理学测试时，首先，上层通道部件12与下层通道部件14以夹入其间的状态与多孔膜28接合而制作如图2所示的包括上层微通道16及下层微通道22的血管模型10。将血管内皮细胞层36及细胞层38设置于多孔膜28的主表面。
之后，利用泵，使包含药物的血液稀释液通过管状物(未图示)及贯穿孔20a流进上层微通道16，通过上层微通道16的内部并使其通过贯穿孔20b及管状物(未图示)，由此流出血管模型10。
同时，利用泵，使培养溶液或生理盐水溶液通过管状物(未图示)及贯穿孔26a流进下层微通道22，通过下层微通道22的内部并使其通过贯穿孔26b及管状物(未图示)，由此流出血管模型10。血液稀释液流过的上层微通道16内的压力高于培养溶液或生理盐水溶液流通的下层微通道22内的压力。
在毒理学测试开始时，如图3所示，多孔膜28的整个上表面28a整个下表面28b分别被血管内皮细胞层36及细胞层38覆盖。因此，血液中的红血球无法通过多孔膜28并且不会泄露至下层微通道22。
然而，自毒理学测试开始经过一定时间后，血管内皮细胞层36会因药物毒性而受到损伤。除了血管内皮细胞层36以外，细胞层38也会因药物而受到损伤。通过测量因这些损伤部分而通过多孔膜28，流进下层微通道22的红血球，即通过实施渗漏测试，能够评价血管内皮细胞层36及细胞层38的药物性损伤的程度。
而且，当血管内皮细胞层36因药物毒性而受损时，由于血管内皮细胞层36及细胞层38之间的细胞间相互作用，构成细胞层38的细胞状态发生变化，其结果可能在细胞层38上产生裂缝。通过测量通过间隙并流进下层微通道22的红血球，即通过实施渗漏测试，能够评价血管内皮细胞层36的药物性损伤的程度及细胞层38的反应程度。
多孔膜28上的开口覆盖率越高且多孔膜28的膜厚越薄，则血管内皮细胞层36及细胞层38之间的细胞间相互作用变得越活跃，因此该测试能够以高灵敏度实施。
而且，在上述毒理学测试中，代替血液稀释液使药物及包含示踪剂的溶液流通上层微通道16。示踪剂的例子包括荧光标记化学物质、包含放射性同位素的化学物质、染料化合物等，更具体而言，包括选自包括葡聚糖、伊文思蓝、荧光素钠及fitc微球的组中的至少一种。荧光染料优选为激发波长/荧光波长为580nm/605nm的红色。
根据示踪剂的种类测量荧光强度、放射线或色度以定量示踪剂，并测量通过多孔膜28而从上层微通道16流入下层微通道22的示踪剂的量，由此能够评价血管内皮细胞层36及细胞层38的药物性损伤程度。
本例示性实施方式构成为，上层微通道16与下层微通道22在多孔膜28上被分隔，贯穿孔30的开口30a的平均开口直径为1μm～20μm，贯穿孔30的开口30a的开口覆盖率为30％～70％。因此，在渗漏测试期间，红血球流过上层微通道16并通过多孔膜28上的贯穿孔30而移动至下层微通道22时，能够抑制红血球的移动受到多孔膜28的阻碍。
另外，本例示性实施方式构成为，多孔膜28的膜厚为贯穿孔30的开口30a的平均开口直径的一半以下。因此，相较于多孔膜28的膜厚大于贯穿孔30的开口30a的平均开口直径的一半的情况，红血球更易于通过多孔膜28上的贯穿孔30。因此，本例示性实施方式可进一步提高渗漏测试的准确度。
另外，本例示性实施方式构成为，将贯穿孔30的开口30a排列成蜂窝状，通过连通孔34与多孔膜28内的贯穿孔30彼此连通。贯穿孔30的开口30a的开口直径的变异系数为10％以下，多孔膜28的孔隙率为50％以上。因此，红血球能够更均匀地通过多孔膜28上的多个贯穿孔30。因此，本例示性实施方式可进一步提高渗漏测试的准确度。
另外，本例示性实施方式构成为，血管内皮细胞层36设置于多孔膜28的上表面28a，而细胞层38设置于多孔膜28的下表面28b。细胞层38由选自包括平滑肌细胞、间充质干细胞、周细胞及成纤维细胞的组中的细胞构成。另外，多孔膜28由拉伸断裂伸长率为50％以上且10％拉伸所需的应力为1000gf/mm2以下的挠性材料构成。由此，在本例示性实施方式中，血管模型10可构成为更接近实际血管。
对本发明的例示性实施方式的实施例进行了说明。然而，本发明并不限于上述，在不脱离本发明的主旨的范围内，可进行各种变更。
例如，在上述例示性实施方式中，多孔膜28上的贯穿孔30的开口30a在俯视观察下为圆形，但如图5所示，多孔膜48上的贯穿孔50的开口50a在俯视观察下可以为椭圆形。通过将贯穿孔50的开口50a构成为椭圆形，例如，圆盘形红血球可容易通过贯穿孔50的开口50a，而血液中的其他细胞则不容易通过贯穿孔50的开口50a。
将贯穿孔50的开口50a的开口50a形成为椭圆形的方法的例子包括，在多孔膜48上形成如图4所示的圆形开口30a之后，将多孔膜48沿一个方向(图4中的左右方向)拉伸的方法。该方法能够形成沿同一方向(图5中的左右方向)具有长轴方向的多个椭圆形开口50a。
椭圆形开口50a可利用压缩成型等直接形成于多孔膜48，而不用拉伸多孔膜48。另外，只要开口50a的形状在俯视观察下为具有长轴和短轴的平面形状，则开口50a的形状例如可以是通过拉伸正多边形而获得的平面多边形。
在上述例示性实施方式的多孔膜28中，贯穿孔30的开口30a在多孔膜28的整个主表面规则地排列。然而，如图6所示，多孔膜58可具备形成有贯穿孔60的开口60a的多孔区域62及未形成有贯穿孔60的开口60a的无孔区域64(图6中以双点划线标记的区域)。
具体而言，在多孔膜58，配置于构成图1所示的上层微通道16的凹部18的进口18a附近及出口18b附近的部分及配置于构成图1所示的下层微通道22的凹部24的进口24a附近及出口24b附近的部分例如构成为无孔区域64。
通常，血液等液体流动容易在进口18a及24a和出口18b及24b受到阻挠。因此，通过将多孔膜58在进口18a及24a附近和出口18b及24b附近构成为无孔区域64，可以调整血液等液体在上层微通道16及下层微通道22的流动。因此，多孔膜58可进一步提高渗漏测试的准确度。
本发明的血管模型能够使渗漏测试在抑制伴随药物毒性的红血球等泄漏物质向血管外的移动受到多孔膜的阻碍的状态下进行。因此，本发明的血管模型可用作能够以高准确度进行毒理学测试的血管模型。
以下，对本发明的例示性实施方式的例子进行详细说明。本发明的例示性实施方式不应因以下所示例子而进行限制性解释。
图7a表示实施例1的多孔膜的显微照片。在实施例1，使用了多个贯穿孔的开口排列成蜂窝状，贯穿孔通过连通孔连通的与例示性实施方式的多孔膜28同样地由聚碳酸酯形成的多孔膜。实施例1中，多孔膜的开口的平均开口直径为5μm，开口的开口覆盖率为55％，多孔膜的膜厚为2.2μm，开口的开口直径的变异系数为3.5％，多孔膜的孔隙率为75％，拉伸断裂伸长率为250％，10％拉伸所需的应力为100gf/mm2。
所制作的多孔膜的显微结构利用轮廓扫描激光显微镜(产品名称vk-x100，日本keyence制)测量。利用在一个屏幕上显示50个以上开口的放大率进行了观察。根据所观察的显微照片，对一个屏幕上存在的开口进行了图像分析，以测量各开口直径d并求出开口直径d的平均开口直径dav及变异系数σd。开口直径的变异系数(以％表示)能够利用计算(σd/dav)×100来获得。
通过利用2d图像分析软件winroof(mitanicorp.)，对显微照片进行二值化处理及图像处理来获得了平均开口直径及开口覆盖率。多孔膜的膜厚是利用轮廓扫描激光显微镜在十个点上测量的开口部厚度的平均值。
利用扫描电子显微镜(sem，产品名称su8030，日本hitachi制)观察多孔膜的剖面，并将与贯穿孔相等球体的直径计算为多孔膜的孔隙率。用切片机(产品名称fcs，奥地利reichert制)裁切待评价的多孔膜样品来制作剖面观察用样品，在剖面观察用样品的表面涂布了6nm厚度的os层，并以2kv的加速电压，利用sem观察了样品。利用fudohrheometerrt-2002d·d(rheotechcorp.制)测量了多孔膜的拉伸断裂伸长率及10％拉伸所需的应力。
图7b表示比较例1的多孔膜的显微照片。在比较例1，使用了利用径迹蚀刻工序形成开口的由聚碳酸酯形成的常规技术的多孔膜。比较例1中，多孔膜的开口的平均开口直径为5.7μm，开口的开口覆盖率为12.4％，多孔膜的膜厚为10.6μm，开口的开口直径的变异系数为35％，多孔膜的孔隙率为15％，拉伸断裂伸长率为150％，10％拉伸所需的应力为5800gf/mm2。
多孔膜通过在其两面贴附医用纸来制备。利用镊子移除多孔膜的一表面上的医用纸，并将移除了医用纸的表面朝下地置于下层通道部件。然后利用拭子将多孔膜浸泡在乙醇中而将多孔膜及下层通道部件接合。
接着，利用镊子移除多孔膜的另一表面上的医用纸，并将上层通道部件层叠在多孔膜的另一表面。将上层通道部件及下层通道部件的位置在显微镜下确认的同时排列整齐，并将上层通道部件与下层通道部件接合。由此，分别制作出了实施例1的血管模型及比较例1的血管模型。
在实施例1及比较例1，为了评价多孔膜对红血球的渗透性，所使用的多孔膜不具有设置于其主表面的血管内皮细胞层36或选自包括平滑肌细胞、间充质干细胞、周细胞及成纤维细胞的组中的细胞的细胞层。
在实施例2，使用实施例1的血管模型并在多孔膜的上表面形成大鼠血管内皮细胞层，在多孔膜的下表面形成由大鼠平滑肌细胞构成的细胞层，由此制作了贴附细胞层的血管模型。
在比较例2，使用比较例1的血管模型并在多孔膜的上表面形成大鼠血管内皮细胞层，在多孔膜的下表面形成由大鼠平滑肌细胞构成的细胞层，由此制作了贴附细胞层的血管模型。
在实施例2及比较例2，大鼠血管内皮细胞使用了angio-proteomie制大鼠动脉内皮细胞，大鼠平滑肌细胞则使用了lonza制大鼠主动脉平滑肌细胞。在下层微通道最初接种了细胞浓度为3×106细胞/ml的大鼠平滑肌细胞的细胞悬浮液100μl。培养一天之后，在上层微通道接种了细胞浓度为3×106细胞/ml的大鼠血管内皮细胞的细胞悬浮液100μl。培养两天后，获得了实施例2及比较例2的细胞层粘附血管模型。
使红血球数量为3.7×105细胞/ml的血液稀释液在实施例1及比较例1中制作的血管模型的上层微通道中流通，使生理盐水溶液在它们的下层微通道流通。将血液稀释液及生理盐水溶液的液体输送速率设为500μl/min，上层微通道的内压设为约8.7kpa，下层微通道的内压设为约1.3kpa，由此设定接近实际血管内的血流及血压条件的参数。
关于下层微通道内即生理盐水溶液内的红血球数量，自液体输送开始经过一定时间后，实施例1中的红血球数为9.2×104细胞/ml，而比较例1的血管模型中的红血球数为2.2×104细胞/ml。
该测试能够确认，在与血压条件相等的条件下，实施例1及比较例1的多孔膜均对红血球具有渗透性。而且，相较于比较例1的多孔膜，红血球更容易通过实施例1的多孔膜，因此能够确认到本例示性实施方式的多孔膜能够抑制红血球的移动受到阻碍。
使包含浓度为1.81×106球/ml的作为示踪剂的荧光微球的培养基稀释液在实施例2及比较例2中制作的细胞层粘附血管模型的上层微通道流通，不包含荧光微球的培养基则在下层微通道流通。荧光微球具有4μm的直径，并用具有580nm的激发波长及605nm的荧光波长的红色荧光染料作标记。将包含荧光微球的培养基稀释液及不包含荧光微球的培养基的液体输送速率设为500μl/min，上层微通道的内压设为约8.7kpa，下层微通道的内压设为约1.3kpa，由此设定接近实际血管内的血流及血压条件的参数。
关于下层微通道内即培养基内的荧光微球的数量，自液体输送开始经过一定时间后，实施例2中的荧光微球数为6.5×104球/ml，而比较例2中的荧光微球数为9.2×103球/ml。使以1.81×106球/ml包含荧光微球的生理盐水稀释液在实施例1及比较例1中制作出的血管模型的微通道流通，使生理盐水在下层微通道流通。将液体输送速率设为500μl/min。关于下层微通道的荧光微球的数量，实施例1中的荧光微球数为1.7×105球/ml，而比较例1中的荧光微球为4.3×104球/ml。该测试能够确认到在多孔膜的两面形成细胞层会降低多孔膜对荧光微球的渗透性，并对多孔膜赋予屏障特性。
使细胞松弛素这一药物以50μg/ml的浓度及0.7μl/min的流速，经1天流通各上层微通道及下层微通道，由此将在实施例2及比较例2中制作的细胞层粘附血管模型的多孔膜的两面的细胞层暴露在药物中。
在药物暴露后，利用与上述细胞层粘附血管模型用荧光微球渗透性测试相同的方法，进行了荧光微球渗透性测试。关于下层微通道内即培养基内的荧光微球的数量，自液体输送开始经过一定时间后，实施例2中的荧光微球数为1.7×105球/ml，而比较例2中的荧光微球数为6.7×103球/ml。
该测试能够确认，细胞层因药物受到损伤之后，在实施例2及比较例2的细胞层粘附血管模型中，荧光微球能够通过多孔膜。而且，相较于比较例2的多孔膜，荧光微球更能通过实施例2的多孔膜，因此能够确认到本例示性实施方式的多孔膜能够抑制荧光微球的移动受到阻碍。由此，确认到本例示性实施方式的多孔膜能够在血管模型中以高灵敏度评价药物毒性。
在实施例3，与实施例2同样地制作了具有形成于多孔膜的上表面的大鼠血管内皮细胞层及形成于多孔膜的下表面的大鼠平滑肌细胞层的细胞层粘附血管模型。
在比较例3，与实施例2同样地制作了具有形成于多孔膜的上表面的大鼠血管内皮细胞层及形成于多孔膜的下表面的大鼠平滑肌细胞层的细胞层粘附血管模型。
实施例3及比较例3中使用的细胞与实施例2及比较例2中使用的细胞相同。为了形成细胞层，下层微通道最初接种了细胞浓度为3×106细胞/ml的大鼠平滑肌细胞的100μl的细胞悬浮液。培养一天之后，上层微通道接种了细胞浓度为1×106细胞/ml的大鼠血管内皮细胞的100μl的细胞悬浮液并培养了6小时。然后，利用泵，使各培养基(大鼠ec培养基/smc培养基)以0.7μl/min液体输送速率流通各通道。培养两天后，获得了实施例3及比较例3的细胞层粘附血管模型。
关闭在实施例3及比较例3中制作的细胞层粘附血管模型的下层微通道，使包含浓度为12.5μg/50μl的fitc-葡聚糖(46945，sigma-aldrich制)作为示踪剂的培养基稀释液流通上层微通道。将包含fitc-葡聚糖的培养基稀释液的液体输送速率设为7μl/min。
使fitc-葡聚糖在通道中流通2分钟之后，利用倒置显微镜(产品名称eclipsets2，nikon制)使微通道的荧光成像。关于成像参数，使用了4倍放大率、1600的增益、60ms曝光时间。将这些结果示于图8a及图8b。在实施例3及比较例3，在下层通道均未发现荧光。这表明fitc-葡聚糖未从上层通道渗透到下层通道。该测试能够确认，在多孔膜的两面形成细胞层会阻碍fitc-葡聚糖渗透，并对多孔膜赋予屏障功能。
使非诺多泮(fenoldopam)这一药物以500ng/ml的浓度及0.7μl/min的流速，经1天流通上层微通道，由此将在实施例3及比较例3中制作的细胞层粘附血管模型的多孔膜的血管内皮细胞层暴露在药物中。
在药物暴露后，利用与上述细胞层粘附血管模型用fitc-葡聚糖渗透性测试相同的方法，进行了fitc-葡聚糖渗透性测试。将这些结果示于图9a及图9b。在实施例3的细胞层粘附血管模型，除了在上层微通道以外，也在包括下层微通道的广范围内观察到了荧光。在比较例3的细胞层粘附血管模型，在下层微通道观察到的荧光最少。该测试能够确认，细胞层因药物受到损伤之后，在实施例3及比较例3的细胞层粘附血管模型中，fitc-葡聚糖能够通过多孔膜。而且，实施例3的多孔膜对fitc-葡聚糖的渗透性高于比较例3的多孔膜，由此能够确认到本例示性实施方式的多孔膜并不阻碍fitc-葡聚糖的移动。由此，确认到本例示性实施方式的多孔膜能够在血管模型中以高灵敏度评价药物毒性。
在实施例4，通过在实施例1的血管模型的上层及下层通道的直线部分设置12mm×0.2mm的开口而制作了血管模型。通过在下层通道部件与多孔膜之间插入形成有0.2mm宽的狭缝的聚丙烯强化部件来形成了开口。该强化部件具有100μm厚度。图10a及图10b表示实施例4的多孔膜的显微照片。
在实施例5，在实施例1的血管模型的多孔膜上，以60℃喷射15分钟胶原蛋白(5005-100ml，advancedbiomatrix制)之后使胶原蛋白干燥来形成厚涂层，之后在多孔膜的上表面形成血管内皮细胞层，在多孔膜的下表面形成大鼠平滑肌细胞，由此形成了细胞层粘附血管模型。图11表示实施例5的多孔膜的显微照片。
在实施例6，使用实施例4的血管模型，在多孔膜的上表面形成大鼠血管内皮细胞层而形成了粘附有单一细胞层的血管模型。
使包含浓度为1.81×106球/ml的荧光微球作为示踪剂的培养基稀释液在实施例6中制作的粘附有单一细胞层的血管模型的上层微通道流通，使不包含荧光微球的培养基在血管模型的下层微通道流通。荧光微球的直径为4μm，并用具有580nm的激发波长及605nm的荧光波长的红色荧光染料作标记。将包含荧光微球的培养基稀释液及不包含荧光微球的培养基的液体输送速率设为500μl/min，上层微通道的内压设为约8.7kpa，下层微通道的内压设为约1.3kpa，由此设定接近实际血管内的血流及血压条件的参数。
关于下层微通道内即培养基内的荧光微球的数量，自液体输送开始经过一定时间后，实施例6中的荧光微球数为2.67×104球/ml。使以1.81×106球/ml包含荧光微球的生理盐水稀释液流通实施例4的血管模型的上层通道，使生理盐水以500μl/min的液体输送速率通过下层通道，从而在实施例4获得了7.23×105球/ml的荧光微球数。该测试能够确认到在多孔膜的一表面形成细胞层会降低多孔膜对荧光微球的渗透性，并对多孔膜赋予屏障特性。
在实施例7，使用实施例1的血管模型，在多孔膜的上表面形成源自诱导性多能干细胞的人血管内皮细胞层，并在多孔膜的下表面形成人间充质干细胞，由此制作了细胞层粘附血管模型。
在实施例8，使用了多个贯穿孔的开口排列成蜂窝状，贯穿孔通过连通孔连通，与例示性实施方式的多孔膜28同样地由聚碳酸酯形成的多孔膜。实施例8中，多孔膜的开口的平均开口直径为3μm，开口的开口覆盖率为52％，多孔膜的膜厚为1.2μm，开口的开口直径的变异系数为5.0％，多孔膜的孔隙率为80％。
在实施例9，使用实施例8的血管模型，在多孔膜的上表面形成大鼠血管内皮细胞，并在多孔膜的下表面形成大鼠平滑肌细胞，由此制作了细胞层粘附血管模型。
1.一种血管模型，其包括：
一对通道部件，彼此相对且各通道部件包含形成有各自的微通道的相对面；及
多孔膜，包括沿厚度方向贯穿的多个贯穿孔，并且配置于一对通道部件的相对面之间，且将微通道之间隔开，
在所述多孔膜设置血管内皮细胞层以覆盖与微通道中的一个相对的表面，所述贯穿孔的平均开口直径为1μm～20μm，贯穿孔的开口覆盖率为30％～70％。
2.根据权利要求1所述的血管模型，其中，
所述多孔膜的膜厚为贯穿孔的平均开口直径的一半以下。
3.根据权利要求1所述的血管模型，其还包括：
连通孔，形成于多孔膜的内侧而使贯穿孔彼此连通，
所述贯穿孔排列成蜂窝状，
所述贯穿孔的开口直径的变异系数为10％以下，
所述多孔膜的孔隙率为50％以上。
4.根据权利要求1所述的血管模型，其还包括，设置于与另一微通道相对的所述多孔膜的另一表面的细胞层，所述细胞层的细胞选自平滑肌细胞、间充质干细胞、周细胞及成纤维细胞中。
5.根据权利要求1所述的血管模型，其中，
所述多孔膜的拉伸断裂伸长率为50％以上，
所述多孔膜的10％拉伸所需的应力为1000gf/mm2以下。
6.根据权利要求1所述的血管模型，其中，
所述贯穿孔在俯视观察下具有平面形状，并包括长轴和短轴。
7.根据权利要求1所述的血管模型，其中，
所述多孔膜包括形成有贯穿孔的多孔区域及未形成有贯穿孔的无孔区域。
8.一种使用包含药物的血液稀释液来进行渗漏测试的方法，所述方法包括：
提供权利要求1所述的血管模型的工序；
使包含药物的血液稀释液在与设置有血管内皮细胞层的所述多孔膜的表面相对的微通道流通的工序；及
对泄漏至与所述多孔膜的另一表面相对的微通道的红血球数进行计数的工序。
技术总结