技术领域：
本发明涉及荧光探针领域，具体涉及一类双光子荧光探针的合成方法及其在检测谷胱甘肽硫转移酶中的应用。
背景技术：
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谷胱甘肽硫转移酶(gst)是一种重要的解毒酶，它能催化谷胱甘肽(gsh)对外源性物质和内源性亲电体的亲核加成反应，生成的加合物随后会被排出体外，从而达到解毒的效果。癌细胞中gst的表达水平是决定其对化疗敏感度的重要指标。胞浆中三种重要的同工酶(a、m、p亚型)在抗药性肿瘤或肿瘤癌细胞中通常会过表达，因此，为了检测抗癌药抗性，发展能够监测哺乳动物肿瘤细胞中gst同工酶含量的高灵敏性探针是十分必要的。
目前，发展出来的检测gst活性的方法只有少数几种，比如1-氯-2,4-二硝基苯(cdnb)是广泛使用的一种检测试剂，但它的应用受限于低灵敏度(吸光光度法的通病)、高背景噪音和选择性差等缺点。
荧光探针技术是有效检测gst的手段之一，因为该技术相对来说技术性要求并不高，易于实用化，而且检测灵敏度高。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、合成简单等优点。tetsuonagano等人公开了一种用于检测gst的荧光探针dnat-me(结构见图1，tetsuonaganoetal.，j.am.chem.soc.,2008,130,14533)，该探针经gst催化与gsh加合后因为对光致电子转移效应(pet)的抑制而使得荧光增强，从而能检测到gst的存在,但是该探针检测机制涉及的荧光性能严重依赖于环境的ph,从而在一定程度上限制了它的应用。于是后来yuutafujikawa等人针对这一问题又继续开发了对ph不敏感的荧光探针3,4-dnadcf(结构见图1，yuutafujikawaetal.，chem.commun.,2015,51,11459)。不过，上述两种探针都只对p亚型gst有特异性响应，而在实际应用中有时需要对各种同工酶具有广谱性响应的荧光探针。因而ralfmorgenstern等人公开了一种用于检测各种gst同工酶的荧光探针dns-cv(结构见图1，ralfmorgensternetal.，j.am.chem.soc.,2011,133,14109)，然而该探针在没有gst的催化作用下依然能与gsh发生一定程度的非酶促反应而产生较大的背景噪音。因此，开发具有更高灵敏度和信噪比的可用于生物体外水环境及生物样品如人癌细胞中的各种gst同工酶检测的荧光探针具有重要意义。
技术实现要素：
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本发明就是针对上述问题，提供了一种可用于双光子激发荧光检测生物体外水环境及生物样品如人癌细胞中的各种gst同工酶的荧光探针的制备方法及应用，此探针可以在生理条件下经β-半乳糖苷酶催化水解，所得产物荧光强度相对于原探针显著增强，同时探针与水解产物均具有双光子吸收性能，可用红外激光进行双光子激发。
本发明采用如下技术方案：在具有较大双光子吸收截面的荧光母体上引入优化后的硝基苯结构作为与谷胱甘肽硫转移酶识别及反应的活性中心，利用反应物与产物的荧光强度差别，实现双光子激发荧光检测gst。所述荧光探针的通式为：
通式ⅰ中，r1、r2为h、烷基、芳基或含杂原子的取代基。r1、r2为烷基、芳基时，为c1～c20的烷基、芳基，优选为c1～c10的烷基、芳基；r1、r2为含杂原子的取代基时，为磺酸基、羧基、羟基、卤素、卤代甲基、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基。
对通式i表示的化合物采用与发射光波段(500～600nm)完全分开且更容易穿透生物样品的红外激光(740～850nm)进行双光子激发用于检测生物体外水环境及生物样品如人癌细胞中的谷胱甘肽硫转移酶，经酶作用后生成具有通式ii结构的化合物，从而导致荧光发生显著的增强，因通式i表示的化合物和通式ii表示的化合物均具有双光子吸收性能，因而此过程可实现对谷胱甘肽硫转移酶的双光子激发荧光检测。
通式ii中，r1为h、烷基、芳基或含杂原子的取代基，r2为-oh或-o-。r1为烷基、芳基时，一般为c1～c20，最佳为c1～c10；r1为含杂原子的取代基时，为含有磺酸基、羧基、羟基、卤素、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基的取代基。
本发明的目的还通过下述方式实现：
一种具有检测gst功能的荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
(1)以硝基氟苯类化合物、亚硫酸钠为原料，合成得到含磺酸基的硝基苯类化合物ⅲ；
(2)以化合物ⅲ和氯化亚砜为原料，合成得到含氯磺酰基的硝基苯类化合物ⅳ；
(3)以化合物ii和ⅳ为原料，合成得到通式ⅰ所示的荧光探针。
上述的具有检测gst功能的荧光探针的合成方法，所述的步骤(1)中的硝基氟苯类化合物，其取代基为烷基、芳基或含杂原子的取代基；取代基为烷基、芳基时，为c1～c20的烷基、芳基，优选为c1～c10的烷基、芳基；取代基为含杂原子取代基时，为磺酸基、羧基、羟基、卤素、卤代甲基、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基。
上述的具有检测gst功能的荧光探针的合成方法，所述的步骤(1)中的反应条件为在三口烧瓶中加入硝基氟苯类化合物、亚硫酸钠、水、甲醇和乙醇，硝基氟苯类化合物与亚硫酸钠的摩尔比为1:1～1:5，水和醇的体积比为1:2～1:10；开动加热搅拌器，温度控制在30～80℃，加热回流5～24h,反应冷至室温后旋干，得化合物ⅲ。
上述的具有检测gst功能的荧光探针的合成方法，所述的步骤(2)中的反应条件为在惰性气体如氮气保护下向三口烧瓶中加入化合物ⅲ和氯化亚砜，化合物ⅲ与氯化亚砜的摩尔比为1:2.5～1:10；开动加热搅拌器，加热回流1～5h,温度为40～80℃，反应冷至室温后旋干，得化合物ⅳ。
上述的具有检测gst功能的荧光探针的合成方法，所述的步骤(3)中的反应条件为在三口烧瓶中加入化合物ii和二氯甲烷，开动搅拌器并使反应物冷却至-10～0℃，在搅拌和氮气保护下滴加溶在二氯甲烷中的化合物ⅳ，化合物ii和ⅳ的摩尔比为1:1～1:5，滴加完毕后加入几滴三乙胺，逐渐升至室温，搅拌反应0.5～5h，旋干后用二氯甲烷和甲醇重结晶得通式ⅰ所示的荧光探针。
一种根据上述的合成方法制备的荧光探针。
根据上述的合成方法制备的荧光探针在检测生物体外水环境及生物样品如人癌细胞中的各种gst同工酶中的应用。
本发明的有益效果：
本发明将硝基氟苯类化合物与亚硫酸钠在水醇混合溶剂中发生的芳香亲核取代(snar)反应制得优化后的识别基团骨架，再与具有双光子吸收性能的萘酰亚胺荧光母体进行连接来制备所需的荧光探针，该荧光探针在各种gst同工酶存在下荧光强度均发生显著增强，可用红外激光进行双光子激发，不仅使发射光与激发光完全分开以消除激发光对检测的影响，而且更容易穿透生物样品，减少背景荧光对检测结果的影响，能够高灵敏性地检测生物体外水环境及生物样品如人癌细胞中的各种gst同工酶，这对于深入研究gst在生物体内的生理和病理作用具有重要意义。相比于现有的一些检测技术，本发明中的荧光探针成本投入较少，合成路线简单，后处理方便。
附图说明：
图1背景技术中所举的已公开的用于检测gst的荧光探针；
图2实施例1～4中合成荧光探针nil的流程图；
图3实施例5中荧光探针nif对提取自肝脏的gst的荧光光谱响应；
图4实施例6中探针nih对各种gst同工酶的酶促响应曲线；
图5实施例7中探针nih对人癌细胞中gst的检测
具体实施方式：
实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。
实施例1探针nil识别基团对应的硝基氟苯化合物的合成：
在1000ml三口烧瓶中加入12.5g(60mmol)1,5-二氟-2,4-二硝基苯、6.66g(66mmol)三乙胺和200ml四氢呋喃，1h内逐滴加入溶液在100ml四氢呋喃中的6.76g(66mmol)二甲胺。开动搅拌器，搅拌2h,旋干，加水静置后过滤，烘干后得nil识别基团对应的硝基氟苯化合物。
实施例2探针nil识别基团对应的带有磺酸基的硝基化合物的合成：
在500ml三口烧瓶中加入30mmolnil识别基团对应的硝基氟苯化合物、40ml乙醇、20ml甲醇，加热得透明溶液，另用40ml水溶解亚硫酸钠并向其中加入20ml乙醇得到悬浊液，将该悬浊液加入到前述溶液中，60℃下搅拌回流20h，反应冷至室温后旋干得8.7g黄色固体。
实施例3探针nil识别基团的合成：
向100ml三口烧瓶中加入5mmolnil识别基团对应的带有磺酸基的硝基化合物和50mmol氯化亚砜，80℃搅拌4h，旋干得探针nil的识别基团。
实施例4探针nil的合成：
在100ml三口烧瓶中加入0.269g(1mmol)4-羟基-n-丁基-1,8萘酰亚胺，氮气保护下加入15ml二氯甲烷，冷至0℃，逐滴加入溶于30ml二氯甲烷中的nil识别基团，加入0.11g(1.1mmol)三乙胺，逐渐升至室温，搅拌2h，旋干，用二氯甲烷和甲醇重结晶得0.518g棕色固体，即为探针nil(通过核磁和紫外检测确定化合物的结构)。
实施例5探针nif对提取自肝脏的gst的荧光光谱响应：
图3所示，在终体积为200μl的酶标板小孔里含有终浓度为20μm的nif、1mmgsh和0.0125mg/ml的提取自肝脏的gst，缓冲液为ph7.4的hepes，用酶标仪检测1h内荧光光谱的变化，可以看出随着时间的推移，荧光强度明显增强，因而探针nif可以实现对gst的荧光检测。
实施例6探针nih对各种gst同工酶的酶促响应曲线：
图4所示，同实施例5的过程，不同之处在于通过改变nih的浓度，可以测得nih对a、m、p亚型的gst的米氏方程曲线，由此可知nih对各种gst同工酶均有荧光响应。
实施例7探针nih对人癌细胞中gst的检测
图5所示，用20μmnih分别孵育富含gst的肝癌细胞hepg2、肺癌细胞a549、宫颈癌细胞hela以及阴性对照细胞mhcc97l细胞30min，并用双光子荧光共聚焦显微镜(双光子红外激发波长为810nm)观察，荧光收集通道为500-600nm，可以看出含有gst的阳性细胞均产生了强烈的荧光，而阴性对照细胞荧光很微弱，从而证明了nih可以检测人癌细胞中的gst。
结论：由以上附图和实施例可见，本发明在具有较大双光子吸收截面的荧光母体上引入优化后的硝基苯结构作为与谷胱甘肽硫转移酶识别及反应的活性中心，利用反应物与产物的荧光强度差别，实现双光子激发荧光检测谷胱甘肽硫转移酶。
1.一种双光子荧光探针，其特征在于：所述荧光探针的结构如通式ⅰ所示：
通式ⅰ中，r1、r2分别为h、烷基、芳基或含杂原子的取代基；
r2为h、烷基、芳基或含杂原子的取代基中的一种、二种、三种或四种，个数为1-4个。
2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：所述的通式ⅰ中r1、r2分别为烷基或芳基时，r1、r2分别为c1～c20的烷基、芳基，优选为c1～c10的烷基、芳基；
r1、r2分别为含杂原子的取代基时，r1、r2分别为磺酸基、羧基、羟基、卤素、卤代甲基、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基。
3.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：，具有如下结构的化合物nia、nib、nic、nie、nif、nig、nih、nii、nil、nin中的一种或二种以上；
4.一种权利要求1、2或3所述的荧光探针在检测水环境或生物样品中的谷胱甘肽硫转移酶过程中的应用。
5.根据权利要求4所述的荧光探针的应用，其特征在于，对通式i表示的化合物采用与发射光波段完全分开且可穿透生物样品的红外激光进行双光子激发用于检测生物体外水环境或生物样品(如人癌细胞)中的谷胱甘肽硫转移酶，经酶作用后生成具有通式ii结构的化合物，从而导致荧光发生显著的增强，此过程可实现对谷胱甘肽硫转移酶的双光子激发荧光检测；
通式ii中，r1为h、烷基、芳基或含杂原子的取代基，r2为-oh或-o-。
6.根据权利要求5所述的荧光探针的应用，其特征在于，r1为烷基、芳基时，一般为c1～c20，最佳为c1～c10；r1为含杂原子的取代基时，为含有磺酸基、羧基、羟基、卤素、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基的取代基。
7.根据权利要求5所述的荧光探针的应用，其特征在于，具有如下结构的化合物nia、nib、nic、nie、nif、nig、nih、nii、nil、nin中的一种或二种以上，均可用于存在于模拟生理环境(ph为7.4的hepes缓冲溶液)中的谷胱甘肽硫转移酶的检测，生成4-羟基-n-丁基-1,8萘酰亚胺，在ph为7.4时，有一部分4-羟基-n-丁基-1,8萘酰亚胺的羟基会脱去质子；
8.根据权利要求4、5、6或7所述的荧光探针的应用，其特征在于，用于双光子激发荧光检测谷胱甘肽硫转移酶，通式i表示的化合物和通式ii表示的化合物均具有双光子吸收性能，从而可在双光子激发下检测谷胱甘肽硫转移酶；
谷胱甘肽硫转移酶的测定包括以下工序：
(a)使具有通式i结构的化合物与谷胱甘肽硫转移酶反应；
(b)测定由上述工序中的反应引起的荧光强度变化。
9.一种权利要求1-3任一所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以硝基氟苯类化合物、亚硫酸钠为原料，合成得到含磺酸基的硝基苯类化合物ⅲ；
(2)以化合物ⅲ和氯化亚砜为原料，合成得到含氯磺酰基的硝基苯类化合物ⅳ；
(3)以化合物ii和ⅳ为原料，合成得到通式ⅰ所示的荧光探针；
所述的步骤(1)中的硝基氟苯类化合物，其取代基为烷基、芳基或含杂原子的取代基；
取代基为烷基、芳基时，为c1～c20的烷基、芳基，优选为c1～c10的烷基、芳基；
取代基为含杂原子取代基时，为磺酸基、羧基、羟基、卤素、卤代甲基、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基。
10.根据权利要求9所述的合成方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的反应条件为在三口烧瓶中加入硝基氟苯类化合物、亚硫酸钠、水、甲醇和乙醇，硝基氟苯类化合物与亚硫酸钠的摩尔比为1:1～1:5，水和醇的体积比为1:2～1:10；
开动加热搅拌器，温度控制在30～80℃，加热回流5～24h,反应冷至室温后旋干，得化合物ⅲ；
所述的步骤(2)中的反应条件为在惰性气体如氮气保护下向三口烧瓶中加入化合物ⅲ和氯化亚砜，化合物ⅲ与氯化亚砜的摩尔比为1:2.5～1:10；
开动加热搅拌器，加热回流1～5h,温度为40～80℃，反应冷至室温后旋干，得化合物ⅳ；
所述的步骤(3)中的反应条件为在三口烧瓶中加入化合物ii和二氯甲烷，开动搅拌器并使反应物冷却至-10～0℃，在搅拌和氮气保护下滴加溶在二氯甲烷中的化合物ⅳ，化合物ii和ⅳ的摩尔比为1:1～1:5，滴加完毕后加入几滴三乙胺，逐渐升至室温，搅拌反应0.5～5h，旋干后用二氯甲烷和甲醇重结晶得通式ⅰ所示的荧光探针。
技术总结