一种靶向HPK1的gRNA和一种编辑HPK1基因的方法与流程

相关申请的交叉引用本申请要求于2017年9月20日提交的中国申请号201710853090.2的优先权，将其内容通过引用整体并入本文。在各种实施方式中，本发明涉及分子生物学和免疫学的
技术领域：
，并且更具体地涉及癌症免疫疗法。例如，在各种实施方式中，本发明通常涉及用于编辑hpk1基因的组合物和方法，具有被编辑的hpk1基因的细胞(如t细胞、nk细胞和nkt细胞)，包括该细胞的药物组合物和使用所述药物组合物，例如，用于治疗癌症，的方法。
背景技术：
：肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一，近年来针对肿瘤的免疫疗法逐渐成为肿瘤治疗的研究热点。肿瘤免疫细胞疗法是对从人体内采集的免疫细胞进行体外修饰、培养和扩增，再回输到病人体内以激发和增强机体自身免疫功能，从而达到抑制肿瘤生长、杀伤肿瘤细胞的效果。在诸多癌症免疫治疗方法中，机理相对清楚、效果较为确切的是嵌合抗原受体t细胞肿瘤靶向治疗(car-t细胞治疗)和pd-1抑制剂疗法。包括car-t在内的细胞免疫疗法在血液肿瘤治疗方面取得了显著的成功，但攻克实体瘤一直存在着障碍。主要的原因是t细胞衰竭、活性降低，对肿瘤杀伤力不足，因此发现新的t细胞体外修饰位点和修饰方法，提高t细胞活性和杀伤力，抑制t细胞衰竭是未来研究和技术发展的方向。造血祖细胞激酶1(缩写为hpk1、hpk1、hpk-1或map4k1)是造血系统特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于哺乳动物ste20相关蛋白激酶的map4k家族。hpk1主要在造血组织和细胞中表达。大量研究已表明，hpk1参与许多信号级联反应，包括mapk(丝裂原活化蛋白激酶)信号、抗原受体信号、凋亡信号、生长因子信号以及细胞因子信号等。hpk1存在3种激活方式，即丝氨酸磷酸化、苏氨酸磷酸化或酪氨酸磷酸化。1996年应用pcr技术首次将hpk1从小鼠造血祖细胞中克隆出来后，研究已表明hpk1主要在造血组织和细胞中表达，目前对于hpk1的研究主要集中在造血系统。最新的研究已表明hpk1与癌症可能存在相关性。sawasdikosols.等人对小鼠模型的研究发现破坏t细胞、dc细胞的hpk1基因有助于抑制肺癌细胞生长，且hpk1可望成为抗肿瘤免疫治疗的新靶点。us20160158360披露了将抑制hpk1丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的hpk1拮抗剂与pd-1拮抗剂联合用于治疗癌症的用途。技术实现要素：在各种实施方式中，本发明提供了与hpk-1基因破坏有关的细胞、细胞组合物、核酸和载体，及其制备方法和使用方法。本发明的一些实施方式涉及包含hpk-1基因的基因破坏(例如，基因敲除)的免疫细胞，和/或一种诱导或能够诱导基因破坏的试剂。所述基因破坏可以包括hpk-1基因的缺失、突变和/或插入，从而导致hpk-1基因失活、活性降低和/或表达降低。例如，在一些实施方式中，所述基因破坏可以包括hpk-1基因的至少一个外显子(例如，第一或第二外显子)的至少一部分缺失。在本文所述的任何实施方式中，所述基因破坏还可以包括在hpk-1基因(例如，在第一或第二外显子)中产生双链断裂(dsb)，其通过影响hpk-1基因的插入和缺失(插入缺失标记)的非同源末端连接(nhej)修复。在一些实施方式中，所述基因破坏还可以包括在hpk-1基因中产生双链断裂，其通过同源性定向修复(hdr)修复以在dsb之后插入供体序列(如编码本文所述car的序列)。在一些实施方式中，所述基因破坏可以包括以下一种或多种：免疫细胞不表达内源性hpk-1多肽，不包含连续的hpk-1基因、hpk-1基因和/或功能性hpk-1基因。多种试剂可用于影响本文的基因破坏。例如，在一些实施方式中，所述试剂可以是抑制性核酸分子，如rna干扰剂。在一些实施方式中，所述抑制性核酸分子是、包括或编码小干扰rna(sirna)、微rna适应性shrna、短发夹rna(shrna)、发夹sirna、前体微rna(pre-mirna)或微rna(mirna)。在一些实施方式中，所述抑制性核酸分子包括与hpk-1基因的核酸序列(例如，mrna)互补的序列。在一些实施方式中，所述试剂可以包括降低或能够降低免疫细胞中hpk-1表达的一种或多种分子，或编码所述一种或多种分子的多核苷酸。在一些实施方式中，所述一种或多种分子可以是、包括或编码反义分子、sirna、shrna、mirna、基因编辑核酸酶、锌指核酸酶蛋白(zfn)、tal效应子核酸酶(talen)或crispr-cas9组合，所述crispr-cas9组合特异性结合、识别或杂交hpk-1基因。在一些具体实施方式中，所述试剂可以包括(a)具有与hpk-1基因的靶结构域互补的靶向结构域的grna，或编码所述grna的多核苷酸；(b)cas9蛋白，或编码所述cas9蛋白的多核苷酸，或(a)和(b)的组合。在一些实施方式中，所述试剂可以包括cas9分子的核糖核蛋白复合物(或分子复合物或简单复合物或rnp)和具有与hpk-1基因的靶结构域互补的靶向结构域的grna。多种grna和cas9蛋白是合适的，包括本文所述的那些grna和cas9蛋白。。例如，在一些实施方式中，grna可以具有靶向序列，所述靶向序列与靶序列完全互补的序列相同或差异不超过1、2或3个核苷酸，所述靶序列选自seqidno：1和11-15。在一些实施方式中，grna可以具有与选自seqidno：1和11-15的靶序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％互补的靶序列，例如完全互补的。grna可以是嵌合的或模块化的。在一些实施方式中，cas9蛋白是化脓链球菌cas9。在一些实施方式中，通过插入核定位序列(例如，在cas9分子的c端和n端中的一者或二者插入)进一步修饰cas9蛋白，所述核定位序列可以促进cas9分子进入哺乳动物(例如，人)免疫细胞的细胞核。在本文的任何实施方式中，grna/cas9的复合物可以双链断裂切割靶结构域，其允许通过nhej或hdr修复hpk-1基因。一些实施方式还涉及编码本文试剂的核酸和载体。适用于本文使用的载体包括但不限于质粒载体和病毒载体，如逆转录病毒载体、慢病毒载体或其他载体(如腺病毒载体或腺相关载体)。包括核酸或载体的细胞也是本发明的一个实施方式。在一些实施方式中，本文的免疫细胞优选还包括在免疫细胞表面表达的重组受体或编码所述重组受体的多核苷酸。通常，所述重组受体与抗原特异性结合，并且所述免疫细胞能够在所述重组受体与抗原结合后诱导细胞毒性、增殖和/或分泌细胞因子。多种重组受体(包括本文所述的那些重组受体)是合适的。例如，在一些实施方式中，所述重组受体是重组t细胞受体。在一些实施方式中，所述重组受体是嵌合抗原受体(car)。本文描述了非限制性可用的重组tcr和car。例如，在一些实施方式中，所述重组受体(例如，car)可以特异性结合独立地选自以下的一种或多种抗原：rorl、her2、ll-cam、cd19、cd20、cd22、cea、乙型肝炎表面抗原、叶酸受体抗体、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd276、cd44、egfr、egp-2、egp-4、epha2、erbb2、erbb3、erbb4、fbp、胎儿型乙酰胆碱受体、gd2、gd3、hmw-maa、il-22r-α、il-13r-α2、kdr、κ轻链、lewisy、l1细胞粘附分子(cd171)、mage-a1、间皮素、muc1、muc16、psca、nkg2d配体、ny-eso-1、mart-1、gp100、瘤胎抗原、tag72、vegf-r2、癌胚抗原(cea)、前列腺特异抗原、psma、雌激素受体、孕激素受体、ephrinb2、cd123、cs-1、c-met、gd-2、magea3、ce7、wilms肿瘤1(wt-1)、细胞周期蛋白a1(ccna1)、bcma和白介素12。多种免疫细胞可以用于本发明的组合物和方法。在一些实施方式中，所述免疫细胞是人细胞。在一些实施方式中，所述免疫细胞包括t细胞(如car-t细胞)、nkt细胞和nk细胞。在一些实施方式中，所述免疫细胞可以用于过继免疫疗法。在一些实施方式中，所述免疫细胞可以源自患有癌症的受试者的原代细胞，所述癌症如淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、b细胞急性淋巴细胞性白血病(b-all)、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、弥漫性大细胞淋巴瘤(dlcl)、多发性骨髓瘤、肾细胞癌(rcc)、神经母细胞瘤、直肠结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肉瘤、前列腺癌、肺癌、食道癌、肝细胞癌、胰腺癌、星形细胞瘤、间皮瘤、头颈癌和/或髓母细胞瘤。与不具有基因破坏的对照免疫细胞相比，本文中具有hpk-1基因破坏的免疫细胞或细胞群特征还可以在于某些增强的特征。例如，在一些实施方式中，具有hpk-1基因破坏的免疫细胞或细胞群的特征可以在于细胞毒性增强、细胞凋亡减少、持久性改善和/或衰竭减少。在一些实施方式中，本发明提供了包括本文免疫细胞(例如，t细胞，如car-t细胞)的细胞群，其特征在于hpk-1基因敲除效率至少约为50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，例如，通过根据实施例4中所述t7e1测定和/或实施例5中westernblot的方法确定。在一些实施方式中，所述细胞群的进一步特征在于至少约50％、75％、80％、85％或90％的细胞在细胞表面包括重组受体(例如，嵌合抗原受体，例如，如本文所述)。在一些实施方式中，所述细胞群的进一步特征在于，通过流式细胞术确定，在细胞表面表达pd-1、tim-3和/或lag-3的细胞群中的细胞百分比低于在对照细胞群中的细胞百分比；通过流式细胞术确定，在细胞表面表达膜联蛋白v的细胞群中的细胞百分比低于对照细胞群中的细胞百分比；和/或通过流式细胞术确定，在细胞表面表达cd107a的细胞群中的细胞百分比高于对照细胞群中的细胞百分比。本发明的一些实施方式涉及一种产生免疫细胞的方法，例如，一种改变t细胞的方法。在一些实施方式中，所述方法包括将诱导或能够诱导hpk1基因的基因破坏(例如，基因敲除)的试剂引入免疫细胞(例如，t细胞)。在一些实施方式中，所述方法包括(a)从人类患者(例如，如本文所述)获得免疫细胞(例如，t细胞)；(b)在免疫细胞(例如，t细胞)中引入诱导或能够诱导hpk-1基因破坏的试剂；(c)用所述试剂孵育并可选地扩增免疫细胞(例如，t细胞)以提供hpk-1基因破坏的免疫细胞(例如，t细胞)群。在一些实施方式中，所述方法进一步包括在免疫细胞(例如，t细胞)中引入编码重组受体(如本文所述car或其产物)的核酸。合适的免疫细胞和试剂包括本文所述的那些免疫细胞和试剂。例如，在一些实施方式中，可以将免疫细胞引入任何grna/cas9复合物，例如，其可以经hpk-1基因中的双链断裂切割靶结构域，从而通过免疫细胞中的nhej或hdr修复hpk-1基因。通过本文的方法产生的免疫细胞或细胞群特征可以在于如本文所述的如hpk-1基因敲除效率，衰竭标志物pd-1、tim-3和/或lag-3的表达，细胞凋亡标志物膜联蛋白v的表达，细胞毒性标志物cd107a的表达的任何特征。本发明的一些实施方式涉及一种增强免疫细胞用于免疫疗法的功能的方法。在一些实施方式中，本发明提供了一种增强免疫细胞群的细胞毒性、抑制衰竭和/或增强其在脾脏和/或肿瘤中的浸润的方法，所述方法包括将免疫细胞群与试剂接触，所述试剂诱导或能够诱导hpk1基因的基因破坏(例如，基因敲除)。在一些实施方式中，所述方法包括(a)从人类患者(例如，如本文所述)获得免疫细胞(例如，t细胞)群；(b)在免疫细胞(例如，t细胞)群中引入诱导或能够诱导hpk-1基因破坏的试剂；和(c)用所述试剂孵育并可选地扩增免疫细胞(例如，t细胞)以提供hpk-1基因破坏的免疫细胞(例如，t细胞)群，与引入试剂之前的细胞群相比，所述hpk-1基因破坏的免疫细胞(例如，t细胞)群具有增强的细胞毒性、降低的衰竭和/或在脾脏和/或肿瘤中增强的浸润。在一些实施方式中，所述方法进一步包括在免疫细胞(例如，t细胞)中引入编码重组受体(如本文所述car或其产物)的核酸。合适的免疫细胞和试剂包括本文所述的那些免疫细胞和试剂。例如，在一些实施方式中，可以将免疫细胞引入任何grna/cas9复合物，例如，其可以经hpk-1基因中的双链断裂切割靶结构域，从而通过免疫细胞中的nhej或hdr修复hpk-1基因。本发明的一些实施方式涉及包括具有hpk-1基因破坏的免疫细胞或本文的细胞组合物的药物组合物。本发明的一些实施方式涉及治疗疾病或病症的方法。在一些实施方式中，所述疾病或病症是感染性疾病或病症、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。在一些实施方式中，所述疾病或病症可以是癌症或肿瘤，其是白血病、淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、急性淋巴细胞性白血病(all)、非霍奇金淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性b细胞淋巴瘤、b细胞恶性肿瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑素瘤癌、骨癌、脑癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺腺癌、霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、尤因肉瘤、髓母细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤和/或间皮瘤。在一些实施方式中，所述方法包括将治疗有效量的具有hpk-1基因破坏的免疫细胞或本文的细胞组合物给药至有需要的受试者。在一些实施方式中，所述方法包括(a)从需要治疗的受试者获得免疫细胞(例如，t细胞)；(b)在免疫细胞(例如，t细胞)中引入诱导或能够诱导hpk-1基因破坏的试剂；(c)用所述试剂孵育并可选地扩增免疫细胞以提供hpk-1基因破坏的细胞群；和(d)将hpk-1基因破坏的细胞群给药至所述受试者。在一些实施方式中，所述方法进一步包括(e)在免疫细胞(例如，t细胞)中引入编码重组受体(如本文所述car或其产物)的核酸。(b)和(e)的引入步骤可以同时或依次以任何顺序进行。合适的试剂和重组受体包括本文所述的那些试剂和重组受体。附图说明通过阅读以下优选实施方式的详细描述，各种其他优点和益处对于本领域技术人员将变得显而易见。附图仅出于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。图1从左到右示出纯化的体外转录grna的代表性凝胶电泳图像。泳道1是空白对照nc；泳道2是纯化的hpk1grnamrna；泳道3是纯化的pd1grnamrna。图2从左至右示出纯化的表达重组cas9蛋白的代表性凝胶电泳图像：泳道1是蛋白分子量标准；泳道2是浓缩后的重组cas9蛋白(带gst标签)；泳道3是凝血酶去除gst标签后的cas9蛋白；泳道4是浓缩前的重组cas9蛋白(带gst标签)。图3示出琼脂糖凝胶电泳的图像，显示在不同条件下的代表性基因敲除效率，如实施例4所述，通过t7e1酶消化检测，从左至右：泳道1是4×106个t细胞 8μgcas9蛋白 8μghpk1grnamrna；泳道2是4×106个t细胞 8μgcas9蛋白 16μghpk1grnamrna；泳道3是4×106个t细胞 16μgcas9蛋白 8μghpk1grnamrna；泳道4是4×106个t细胞 16μgcas9蛋白 16μghpk1grnamrna；泳道5是4×106个t细胞 8μgcas9蛋白 8μgpd1grnamrna；泳道6是4×106个t细胞 8μgcas9蛋白 16μgpd1grnamrna；泳道7是4×106个t细胞 16μgcas9蛋白 8μgpd1grnamrna；泳道8是4×106个t细胞 16μgcas9蛋白 16μgpd1grnamrna。图4示出westernblot图像，显示代表性基因敲除效率。结果表明，与其他三组相比，car19 hpk1 /-t细胞中hpk1的表达水平显著降低。β-肌动蛋白用作内参。图5显示了流式细胞术结果，其检测cd19 细胞、car19 hpk1 /-t细胞和car19 pd1 /-t细胞的表面标志物car19和pd1受体。图像显示，与对照car19 t细胞相比，car19 hpk1 /-t细胞表面的pd1受体显著减少。pd1受体在car19 hpk1 /-t细胞表面的表达水平接近于在car19 pd1 /-t细胞表面的表达水平。图6a-6c示出比较不同细胞组合物的t细胞杀伤活性的柱状图：t细胞、cd19 t细胞、car19 hpk1 /-t细胞和car19 pd1 /-t细胞。图6a比较了对人慢性髓性白血病细胞k562系的杀伤作用；图6b比较了对类淋巴母细胞raji细胞系的杀伤作用；图6c比较了对人burkkit淋巴瘤细胞系daudi的杀伤作用。图7a和7b示出比较不同细胞组合物的细胞因子产物水平的柱状图：t细胞(cd19-t细胞)、cd19 t细胞、car19 hpk1 /-t细胞和car19 pd1 /-t细胞。图7a比较了ifn-γ的产生水平。图7b比较了il-2的产生水平。图8示出显示不同处理组之间小鼠的肿瘤体积的比较图：t细胞处理组、car-twt处理组、car-thpk1ko处理组和car-tpd1ko处理组。(每组n＝6只小鼠)。***p<0.001，非配对t检验。图9示出用t细胞、car-twt、car-thpk1ko和car-tpd1ko处理的小鼠的图像。在图9中，nsg小鼠接种raji-ffluc细胞，并在7天后用1×106个表达cd19-car的t细胞(含4-1bb/cd3ζ信号模块)或用仅表达egfrt的t细胞处理(每组4-5只小鼠)。箭头标记t细胞转移日期。通过生物发光成像分析肿瘤生长，并针对不同car的个体小鼠的结果作图。对于接受不同cart细胞的小鼠，显示了t细胞转移后7天(d7)至转移后28天(d28)的图像。图10示出后处理40天后小鼠中t细胞、car-twt、car-thpk1ko和car-tpd1ko细胞的持久性图。将过继性t细胞转移至小鼠体内后进行血液中t细胞定量。每组n＝3只小鼠。*p<0.05，**p<0.01，非配对t检验。柱状图和散点图表示平均值±标准误.图11a-11c示出对于各组(t细胞、car-twt、car-thpk1ko和car-tpd1ko细胞)小鼠肿瘤组织中细胞浸润的多种表面标志物膜联蛋白v/cd107a/pd1/tim3/lag3的表达水平的代表性评估。这些图评估了过继转移后第14天起cart细胞的凋亡、细胞毒性和衰竭标志物的表达。图11a示出了显示在肿瘤组织中浸润的细胞上膜联蛋白v/cd107a/pd1/tim3/lag3的表达水平的图。图11b示出了显示在肿瘤组织中浸润的car-t细胞上膜联蛋白v和cd107a的表达水平的柱状图。图11c示出了显示在肿瘤组织中浸润的car-t细胞上pd1、tim3和lag3的表达水平的柱状图。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，非配对t检验。图12显示了动物研究的一般流程图。图13a-13d显示了离体扩增期间her2cart细胞衰竭。a.her2car在t细胞上的表达；b.westernblot评价从初始激活后第0天(初始t细胞)至第10天hpk1在t细胞上的表达，并在第3天转导her2car；c.facs评价从初始激活后第0天(初始t细胞)至第10天hpk1在t细胞上的表达，并在第3天转导her2car；d.荧光显微镜检查不同her2cart细胞中hpk1表达(红色)(pd1表达高低)。图14a-c示出了显示使用带cas9蛋白的sgrna切割hpk1的效率的图和图像。a.facs分析her2car在t细胞中的表达(转导后第3天)；b.westernblot评价crispr/cas9靶向hpk1或pd-1后hpk1的表达；c.facs分析crispr/cas9靶向hpk1或pd-1后pd-1表达。图15a-c示出了显示hpk-1基因敲除的her2cart细胞的体内效率增强的图像和图。在图15a中，nsg小鼠接种skov3-ffluc细胞，并用1×106个表达her2-car的t细胞(含4-1bb/cd3ζ信号模块)或用仅表达egfrt的t细胞处理后7天(每组4-5只小鼠)。箭头标记t细胞转移日期。通过生物发光成像分析肿瘤生长，并针对不同car的个体小鼠的结果制图。对于接受不同cart细胞的小鼠，显示了t细胞转移后7天(d7)至转移后28天(d28)的图像。图15b示出了显示处理小鼠在28天内的肿瘤生长的图(每组n＝6只小鼠)。***p<0.001，非配对t检验。图15c显示了小鼠存活的kaplan-meier分析。skov-3荷瘤小鼠用1×106cart细胞(每组n＝6；点＝一只小鼠)处理。图16示出了显示hpk-1敲除增强肿瘤中cart细胞浸润的图像和图。在用1×106个表达her2-car的t细胞处理后的第10天，从小鼠切除肿瘤组织，并将每个组织用于免疫组织化学(ihc)。在ihc分析中，将抗cd3抗体的组合用于初染。细胞核用dapi(蓝色)染色。ihc样品的显微镜检查以×100放大倍数进行。定量肿瘤中的cart细胞，图16中的图还显示了car-t细胞与肿瘤的比率。**p<0.01，*p<0.05，非配对t检验。图17a-c示出了显示hpk-1敲除增强脾脏中cart细胞浸润的图像和图。在用1×106个表达her2-car的t细胞处理后的第25天，分析肿瘤浸润的her2car-t细胞和脾her2car-t细胞。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，非配对t检验。图18a和b显示hpk-1敲除改善体内her2cart细胞衰竭。图18a显示细胞毒性标志物的分析，图18b显示过继转移后第14天来自小鼠的cart细胞的衰竭标志物表达的分析。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，ns：无显著性。非配对的t检验。图19a和19b显示了bcmacart细胞的敲除和感染效率。图19a显示转导car-bcma慢病毒72h后的感染效率。图19b是westernblot的图像，显示hpk-1基因在电穿孔后被有效敲除，grna：cas9蛋白比率约为1：3。图20显示了pd-1敲除之前(上图)和之后(下图)bmcacart细胞中pd1的表达。图21a-21d示出了显示hpk-1编辑的cart细胞在体外显示抗肿瘤效率提高的图。t细胞和car-bcmat细胞与u266(21a)、rpmi8226(21b)、k562(21c)和k562-bcma(21d)共培养，12h后，检测细胞毒性。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。图22示出了显示hpk1编辑的cart细胞在体外表现出增殖效率提高的图像。t细胞和car-bcmat细胞用csfe孵育，然后与u266和rpmi8226共培养，48h后，通过流式细胞术分析细胞。图23示出了显示抗bcmacar转导的t细胞显著减小多发性骨髓瘤pdx模型中肿瘤大小的图。对于该研究，在接种的肿瘤大小达到100mm3之后静脉注射t细胞，然后在29天内测量肿瘤体积。图24a-24c是显示hpk-1编辑的cart细胞在体内表现出降低t细胞衰竭的柱状图。该图基于静脉内注射t细胞后7天的t细胞衰竭标志物的流式细胞术分析。图25显示了使用具有不同靶向序列的多种sgrna的hpk-1敲除效率。图26显示了通过westernblot测量的敲除效率的代表性定量结果。具体实施方式肿瘤细胞和/或肿瘤微环境中的细胞通常会上调pd-1的配体(如pd-l1和pd-l2)，进而导致表达pd-1的肿瘤特异性t细胞上pd-1连接，传递抑制信号。还常常在肿瘤微环境中的t细胞上(例如，在肿瘤浸润的t细胞上)上调pd-1，这可能在通过抗原受体发出信号或某些其他激活信号后发生。在某些情况下，此类事件可能导致t细胞衰竭，进而导致功能降低。t细胞衰竭可能导致t细胞功能逐渐丧失和/或细胞耗尽(yi等人，(2010)免疫学,129:474-481)。t细胞衰竭和/或t细胞持久性缺乏可能成为过继细胞疗法的疗效和治疗结果的障碍。临床试验表明，与抗原受体(例如，car)表达的细胞接触程度更大和/或更长时间与治疗结果之间存在相关性。wo2016196388和wo2017193107描述了通过基因破坏pd-1基因降低t细胞中pd-1或pdl-1表达的方法和组合物。在本发明之前，对hpk-1在影响免疫细胞功能(如在免疫疗法中)的作用了解甚少。在多种实施方式中，本发明人意外地发现，破坏(例如，敲除)免疫细胞(例如，t细胞)的hpk-1基因可以增强其细胞毒性和/或改善其持久性而减少衰竭，其效果与破坏(例如，敲除)pdcd1基因相似或更佳。例如，如本文中详细显示的，在多种car-t细胞中敲除hpk-1基因意外地还降低了衰竭标志物(如pd-1、lag3和tim3)的表达水平。此外，敲除hpk-1基因也意外地导致细胞毒性标志物cd107a在多种car-t细胞表面的表达水平增加。敲除hpk-1基因还意外地减少了car-t细胞的凋亡，这由表面标志物膜联蛋白v的水平降低所证明。这些特征在过继免疫疗法，如治疗癌症中是有用的。例如，如本文实施例所示，hpk-1基因敲除的car-t细胞在不同动物肿瘤模型中意外地优于野生型car-t细胞，并且其效果与pd-1基因敲除的相应car-t细胞相似或更佳。此外，当进行体内检测时，与野生型car-t细胞和pd-1敲除car-t细胞相比，hpk-1基因敲除的car-t细胞的血浆水平更高，持续时间更长。因此，在多种实施方式中，本发明提供了新型细胞和细胞组合物，其包括免疫细胞(如t细胞和nk细胞)，以及产生和使用该细胞和细胞组合物的方法。在一些实施方式中，本文的细胞特征在于具有编码hpk-1多肽的hpk-1基因的基因破坏和/或包含诱导或能够诱导基因破坏的试剂。在一些实施方式中，细胞是人细胞，如人t细胞(例如，car-t细胞)或nk细胞，例如，来源自癌症患者。本文提供了人hpk-1基因的示例性序列(参见seqidno：16和17；另见ncbi登录号：nm_007181和nm_001042600)。在本文的任何实施方式中，基因破坏可以是基因敲除。在一些实施方式中，基因破坏也可以是基因敲低。在一些实施方式中，具有基因破坏的细胞不表达内源性hpk-1多肽；不含连续的hpk-1基因、hpk-1基因和/或功能性hpk-1基因。在本文的任何实施方式中，本文的细胞还可以包括重组受体，如转基因或工程化t细胞受体(tcr)和/或嵌合抗原受体(car)，其可以通过引入编码此类重组受体或其产物的一个或多个核酸分子进行工程化。在一些实施方式中，重组受体可以是工程化的tcr和功能性非tcr抗原受体，如嵌合抗原受体(car)，包括激活的、刺激性和共刺激性car，及其组合。在一些实施方式中，重组受体与抗原(例如，如本文所述)特异性结合，并且免疫细胞能够在重组受体与抗原结合后诱导细胞毒性、增殖和/或分泌细胞因子。在一些实施方式中，本文的细胞和组合物可用于过继细胞疗法，例如过继免疫疗法。hpk-1基因破坏本发明的多种实施方式涉及具有hpk-1基因的基因破坏和/或包含诱导或能够诱导基因破坏的试剂的免疫细胞。尽管在某些特定的实施方式中，优选hpk-1基因敲除，但是在一些实施方式中，降低功能性hpk-1基因表达的任何基因破坏也可以是有用的并且在本文中考虑。本文的基因破坏可以包括免疫细胞(例如，t细胞，如car-t细胞)中hpk-1表达的降低、缺失、消除、敲除或破坏。例如，在一些实施方式中，基因破坏包括hpk-1的至少一个外显子(例如，第一和/或第二外显子)的一部分缺失。在一些实施方式中，hpk-1基因的基因破坏可以是敲除、插入、错义或移码突变，如双等位基因移码突变、基因的全部或部分缺失(例如，一个或多个外显子或其部分)和/或敲入。本文的基因破坏可以通过多种试剂实现。在一些实施方式中，免疫细胞中hpk-1基因的基因破坏可以通过试剂(如抑制性核酸分子)，如rna干扰(rnai)试剂、短干扰rna(sirna)、短发夹(shrna)、微rna(mirna)、反义rna和/或核酶实现，其可用于选择性抑制或抑制基因的表达。sirna技术包括基于rnai的技术，其利用具有与从基因转录的mrna的核苷酸序列同源的序列和与该核苷酸序列互补的序列的双链rna分子。sirna通常与从该基因转录的mrna的一个区域同源/互补，或者可以是包括与不同区域同源/互补的多个rna分子的sirna。在一些实施方式中，可以通过包括序列特异性或靶向核酸酶的试剂实现基因破坏，所述核酸酶包括dna结合靶向核酸酶和基因编辑核酸酶，如锌指核酸酶(zfn)和转录激活因子样效应子核酸酶(talen)，以及rna向导核酸酶(如crispr相关核酸酶(cas))，这些核酸酶专门设计用于靶向基因或其部分的序列。锌指、tale和crispr系统结合域可以被工程化以结合预定的核苷酸序列，例如，通过工程改造(改变一个或多个氨基酸)天然存在的锌指或tale蛋白的识别螺旋区。工程化的dna结合蛋白(锌指或tale)是非天然存在的蛋白。设计的合理标准包括应用替换规则和计算机算法，以处理数据库中存储现有zfp和/或tale设计的信息以及绑定数据的信息。参见，例如，美国专利号6,140,081；6,453,242；和6,534,261；另见wo98/53058；wo98/53059；wo98/53060；wo02/016536和wo03/016496以及美国公开号20110301073和us20140120622。设计用于本文的crispr系统中的grna的方法包括本领域已知的方法，例如，如wo2017/193107中所述，包括选择、设计和验证靶向结构域的方法。本文提供了示例性靶向结构域，并可将其并入本文所述grna中。描述了选择和验证靶序列以及脱靶分析的方法，例如，mali等人，2013，科学，339(6121):823-826；hsu等人，自然生物技术，31(9):827-32；fu等人，2014，自然生物技术，doi:10.1038/nbt.2808.pubmedpmid:24463574；heigwer等人，2014，自然方法ll(2):122-3.doi:10.1038/nmeth.2812.pubmedpmid:24481216；bae等人，2014，生物信息学，pubmedpmid:24463181；xiaoa等人，2014，生物信息学，pubmedpmid:24389662。还可获得用于优化用户靶序列内grna的选择的软件工具，并且该软件工具可用于选择其他合适的grna以敲除或敲低本文的hpk-1基因。在一些优选的实施方式中，基因破坏是基因敲除。例如，在一些实施方式中，可以使用rna向导核酸酶(如成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)-cas系统，如crispr-cas9系统(例如，如本文所述)，编辑免疫细胞的hpk-1基因位点，其对hpk-1基因具有特异性。在一些实施方式中，该基因编辑导致靶基因座(hpk-1基因座)的插入或缺失，或靶基因座的“敲除”并消除编码蛋白的表达。不希望受到理论的束缚，在一些实施方式中，本文的hpk-1基因编辑(例如，用于敲除)可以通过诱导靶向双链断裂或单链断裂，刺激细胞dna修复机制(包括易错非同源末端连接(nhej)和同源性定向修复(hdr))来进行精确的基因修饰。在一些实施方式中，提供了供体核酸，例如，供体质粒或编码基因工程化抗原受体的核酸，并在引入dsb之后通过hdr将供体核酸插入基因编辑位点。因此，在一些实施方式中，基因的破坏和抗原受体(例如，car)的引入可以同时进行，由此基因的一部分通过敲入或插入car编码核酸而被破坏。然而，在一些实施方式中，未提供供体核酸。在一些实施方式中，在引入dsb之后nhej介导的修复导致插入或缺失突变，其可以例如通过产生错义突变和/或移码而引起基因破坏。在本文所述任何实施方式中，crispr/cas9系统可以产生双链断裂，其通过非同源末端连接修复以实现hpk-1基因中的插入和缺失(插入缺失标记)。在一些实施方式中，除了hpk-1基因外，免疫细胞中基本上没有其他基因被破坏。然而，在一些实施方式中，本发明还预期进一步破坏免疫细胞中的一个或多个基因，例如，通过在免疫细胞中引入靶向编码pd-1或pdl-1多肽的基因的其他试剂。用于破坏编码pd-1或pdl-1多肽的基因的某些试剂是已知的，例如，如wo2016/196388和wo2017/193107中所述。本文的免疫细胞的hpk-1基因破坏效率通常可以很高。例如，在一些实施方式中，在引入用于hpk1基因的敲除或基因破坏的试剂(例如，grna/cas9)的细胞组合物中，至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞包含基因破坏；不表达内源性hpk-1多肽；不包含连续的hpk-1基因、hpk-1基因和/或功能性hpk-1基因。在一些实施方式中，本文的免疫细胞、细胞组合物和方法的特征在于在引入用于hpk1基因的敲除或基因破坏的试剂(例如，grna/cas9)的细胞组合物的细胞中，hpk-1基因内或附近(例如，在切割位点上游或下游100个碱基对之内或约100个碱基对之内、50个碱基对之内或约50个碱基对之内、或者25个碱基对之内或约25个碱基对之内或10个碱基对之内或约10个碱基对之内)的cas9介导的切割效率(％插入缺失标记)至少约为50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在优选的实施方式中，本文的免疫细胞、细胞组合物和方法的特征在于hpk-1基因敲除效率为至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，例如，根据实施例4中所述t7e1测定和/或实施例5中的westernblot方法测定。在一些实施方式中，具有hpk-1基因破坏(例如，基因敲除)的细胞的特征进一步在于某些肽的表达水平。例如，当与除了无hpk-1基因的基因破坏或未引入任何诱导或能够诱导基因破坏的试剂外的基本相同的对照免疫细胞相比，本文的免疫细胞通常可以降低pd-1、tim-3和/或lag-3的水平；增强cd107a的水平；和/或降低膜联蛋白v的水平，例如，通过流式细胞术确定。例如，在一些实施方式中，本文的细胞、细胞组合物和方法的特征还可以在于，通过流式细胞术确定，在细胞表面表达pd-1、tim-3和/或lag-3的细胞群中的细胞百分比低于对照细胞群中的细胞百分比；通过流式细胞术确定，在细胞表面表达膜联蛋白v的细胞群中的细胞百分比低于对照细胞群中的细胞百分比；和/或通过流式细胞术确定，在细胞表面表达cd107a的细胞群中的细胞百分比高于对照细胞群中的细胞百分比。如本文所用，提及“对照(免疫)细胞”或“对照(免疫)细胞群”(也称为“相应的组合物”或“相应的细胞群”、“参比组合物”或“参比细胞群”)是指除了未引入诱导或能够诱导免疫细胞中hpk-1基因的基因破坏(例如，基因敲除)的试剂(例如，cas9/grna)的细胞(如t细胞或t细胞群)之外，在相同或基本相同的条件下获得、分离、生成、产生和/或孵育的免疫细胞(例如，t细胞，如car-t细胞)。在一些实施方式中，除了不包含试剂的引入外，将此类细胞或t细胞与t细胞或已随试剂引入的细胞相同或基本相同地处理，使任何一种或多种可能影响细胞活性或特性(包括与免疫细胞活性和/或衰竭标志物(如pd-1、hpk-1、tim-3、lag-3)有关的一种或多种分子的上调或表达)的条件在细胞之间没有变化或基本上没有变化，除了试剂的引入外。例如，为了评估一种或多种分子(例如，pd-1、hpk-1、tim-3和lag-3)的表达降低和/或上调抑制作用，在已知导致在t细胞中表达和/或上调一个或多个分子的相同条件下，孵育包含引入试剂的t细胞和未引入试剂的t细胞。用于评估t细胞标志物(包括如pd-1、hpk-1、tim-3和lag-3的分子)的表达和/或水平的方法和技术是本领域已知的并且在本文中示例。用于检测此类标志物的抗体和试剂是本领域公知的，并且容易获得。用于检测此类标志物的测定和方法包括但不限于流式细胞术，包括细胞内流式细胞术、elisa、elispot、细胞计数珠阵列或其他多重方法、westernblot和其他基于免疫亲和力的方法。在一些实施方式中，评估标志物在t细胞上的表面表达包括给药后在受试者中检测给予的表达抗原受体(例如，car)的细胞。检测受试者中表达抗原受体(例如，car)的细胞并评估表面标志物的水平在技术人员的水平内。在一些实施方式中，表达抗原受体(例如，car)的细胞，如获自受试者外周血的细胞，可以通过流式细胞术或其他基于免疫亲和力的方法检测用于表达这种细胞特有的标志物，然后可以将这些细胞与另一个t细胞表面标志物共染。在一些实施方式中，表达抗原受体(例如，car)的t细胞可以被产生为包括含截短的egfr(egfrt)作为非免疫原性选择表位，然后可以用作检测这些细胞的标志物(参见，例如，美国专利号8,802,374)。具有重组受体的免疫细胞本文中的细胞通常是待过继转移的免疫细胞(例如，t细胞)(如工程改造为表达car或转基因tcr的细胞)，用于治疗疾病或病症(如癌症)。在一些实施方式中，细胞是人细胞。在一些实施方式中，细胞源自受试者的原代细胞，如受试者的原代免疫细胞(例如，t细胞)，其可以通过引入能够诱导本文的hpk-1基因破坏的试剂(例如，本文所述)进行离体修饰。在一些实施方式中，细胞从受试者分离、工程改造并给药至相同受试者。在一些实施方式中，它们从一名受试者分离，经工程改造并给药至另一受试者。如本文所用，术语“引入”包含体外或体内将dna引入细胞中的多种方法，这些方法包括转化、转导、转染(例如，电穿孔)和感染。载体可用于将编码dna的分子引入细胞。可能的载体包括质粒载体和病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体或其他载体(如腺病毒载体或腺相关载体)。在一些实施方式中，通过引入一种或多种基因工程化核酸或其产物(如基因工程化抗原受体，包括工程化t细胞受体(tcr)和功能性非tcr抗原受体(如嵌合抗原受体(car)，包括激活、刺激和共刺激car，及其组合))以工程化免疫细胞(如t细胞)。在一些实施方式中，还以诱导或能够减少、抑制或破坏细胞中hpk-1基因的试剂以任何顺序同时或依次引入细胞。如本文所示，基因破坏(如hpk-1基因的基因敲除)不干扰本文所述的重组受体(例如，car)的功能特性或此类重组受体的表达。在一些实施方式中，当在相同条件下评估时，与在相应或参比组合物的工程化细胞(其中此类细胞经重组受体工程化，但不包括hpk-1基因被基因破坏)中表达的重组受体相比，本文包括经重组受体工程化并具有hpk-1基因的基因破坏(如敲除)的细胞的组合物保留了重组受体(例如，car)的功能性或活性。在一些实施方式中，重组受体(例如，car)保留与抗原的特异性结合。在一些实施方式中，重组受体(例如，car)在抗原结合后保留激活或刺激活性，以诱导细胞中的细胞毒性、增殖、存活或细胞因子分泌。在一些实施方式中，当在相同条件下评估时，与包括工程化细胞(其中此类细胞经重组受体工程化，但不包括hpk-1基因的基因破坏或不表达hpk-1多肽)相应或参比组合物相比，提供的组合物的工程化细胞保留功能性或活性。在一些实施方式中，与此类相应或参比组合物相比，细胞保留(或增强)细胞毒性、增殖、存活或细胞因子分泌。在一些实施方式中，当在相同条件下评估时，与相应或参比组合物中的细胞表型相比，组合物中hpk-1基因破坏的细胞保留一种或多种免疫细胞的表型。在一些实施方式中，组合物中的细胞包括初始细胞、效应记忆细胞、中枢记忆细胞、茎中枢记忆细胞、效应记忆细胞和长期效应记忆细胞。在一些实施方式中，t细胞或表达重组受体(例如，car)并包括hpk-1基因的基因破坏的t细胞的百分比表现出非激活、长期记忆或中枢记忆表型，其与经重组受体工程化的细胞的相应或参比细胞群或组合物相同或基本相同，但不包括基因破坏或表达hpk-1多肽。在一些实施方式中，本发明的组合物包括t细胞，所述t细胞包括重组受体(例如，car)和一种或多种选自以下的表型标志物：ccr7 、4-1bb (cd137 )、tim3 、cd27 、cd62l 、cd127 、cd45ra 、cd45ro-、t-betlow、il-7ra 、cd95 、il-2rp 、cxcr3 或lfa-1 。用于测量此类特性、活性或表型的方法是本领域已知的，例如，它们可以在体外测定中进行测量，例如，在抗原和/或一种或多种细胞因子(例如，il-2、il-15和/或il-17)存在下，如通过将细胞在37℃ 2℃下或约37℃ 2℃下孵育约12、24、36、48或60小时或约12、24、36、48或60小时。在一些实施方式中，可以在电穿孔或其他试剂引入之后的不同天，如在3、4、5、6、7天或之后，评估任何所评估的活性、特性或表型。在一些实施方式中，在相同条件下评估时，与包含经重组受体工程化的细胞但不包括hpk-1基因的基因破坏的相应组合物相比，组合物中至少80％、85％、90％、95％或100％的细胞保留了这种活性、特性或表型。细胞多种细胞可以用于本发明的组合物和方法。在一些实施方式中，所述细胞(例如，工程化细胞)是真核细胞，如哺乳动物细胞(例如，人细胞)。在一些实施方式中，细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫细胞(例如，髓样或淋巴样细胞)，包括淋巴细胞，通常为t细胞和/或nk细胞。其他示例性细胞包括干细胞(如专能和多能干细胞)，包括诱导性多能干细胞(ipsc)。在一些实施方式中，所述细胞是人细胞。所述细胞通常是原代细胞，如直接从受试者中分离和/或从受试者中分离并冷冻的细胞。在一些实施方式中，所述细胞包括t细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，如整个t细胞群、cd4 细胞、cd8 细胞及其亚群，如通过功能、激活状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体的类型、在特定器官或区室中存在、标志物或细胞因子的分泌特征和/或分化程度定义的那些细胞。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体同源的。这些方法包括现有的方法。在一些实施方式中，例如，对于现成的技术，细胞具有多能性和/或专能性，如干细胞，如诱导型多能干细胞(ipsc)。在一些实施方式中，该方法包括从受试者分离细胞、制备、处理、培养和/或工程化所述细胞，如本文所述，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一患者。在t细胞和/或cd4 和/或cd8 t细胞的亚型和亚群中，有原始t(tn)细胞、效应t细胞(teff)、记忆t细胞及其亚型(如干细胞记忆t(tscmx中枢记忆t(tcm)、效应记忆t(tem)或终末分化的效应记忆t细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、未成熟t细胞、成熟t细胞、辅助性t细胞、细胞毒性t细胞、nkt细胞、粘膜相关不变性t(mait)细胞、天然存在的和适应性调节性t(treg)细胞、辅助性t细胞，如th1细胞、th2细胞、th3细胞、th17细胞、th9细胞、th22细胞、滤泡辅助性t细胞、α/βt细胞和δ/γt细胞。在一些实施方式中，一个或多个t细胞群被对一种或多种特定标志物(如表面标志物)呈阳性(标记“1”)或表达高水平(标记高)的细胞，或者对一种或多种标志物呈阴性(标记“0”)或表达相对低水平(标记低)的细胞富集或耗竭。在某些情况下，这种标志物是在t细胞(如非记忆细胞)的某些群上不存在或以相对较低的水平表达，但在t细胞群(如记忆细胞)的某些其他群上存在或以相对较高的水平表达。在一个实施方式中，细胞(如cd8 细胞或t细胞，例如，cd3 细胞)被cd45ro、ccr7、cd28、cd27、cd44、cd127和/或cd62l呈阳性或表达高表面水平的细胞富集(即，被阳性选择)和/或被对cd45ra呈阳性或表达高表面水平的细胞耗竭(例如，被阴性选择)。在一些实施方式中，细胞被对cd122、cd95、cd25、cd27和/或il7-ra(cd127)呈阳性或表达高表面水平的细胞富集或耗竭。在一些实施例中，cd8 t细胞被对cd45ro(或对cd45ra呈阴性)和cd62l呈阳性的细胞富集。在一些实施方式中，细胞可以是cd4 t细胞群或cd8 t细胞亚群，例如，被中枢记忆(tcm)细胞富集的亚群。在一些实施方式中，细胞是自然杀伤(nk)细胞。在一些实施方式中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如，髓样细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。重组受体对于过继免疫疗法，本文的细胞通常包含重组受体。例如，在一些实施方式中，细胞可以包括一种或多种通过基因工程引入的核酸，以及此类核酸的基因工程产物。在一些实施方式中，核酸是异源的，即，通常不存在于从该细胞获得的细胞或样品中，如从另一种生物或细胞获得，例如，其通常未在工程化细胞和/或源自该细胞的生物中发现。在一些实施方式中，核酸不是天然存在的，如自然界中不存在的核酸，包括一种包括编码来自多种不同细胞类型的多种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。细胞通常表达重组受体，如抗原受体，包括功能性非tcr抗原受体，如嵌合抗原受体(car)，以及其他抗原结合受体，如转基因t细胞受体(tcr)。受体中还包括其他嵌合受体。示例性抗原受体，包括car，以及将这些受体工程化并将其引入细胞的方法，包括例如在国际专利申请公开号wo200014257、wo2013126726、wo2012/129514、wo2014031687、wo2013/166321、wo2013/071154、wo2013/123061，美国专利申请公开号us2002131960、us2013287748、us20130149337，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号ep2537416中所述，和/或如sadelain等人，癌症发现，2013，4月；3(4):388-398；davila等人，(2013)公共科学图书馆·综合，8(4):e61338；turtle等人，免疫学新观点，2012，10月；24(5):633-39；wu等人，癌症，2012，3月，18(2)：160-75所述。在一些实施方式中，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中所述的car，以及国际专利申请公开号wo/2014055668a1中所述的那些抗原受体。car的实施包括上述任何出版物中披露的car，如wo2014031687、us8,339,645、us7,446,179、us2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282、kochenderfer等人，2013，自然评论临床肿瘤学，10，267-276(2013)；wang等人，(2012)免疫治疗期刊，35(9):689-701；和brentjens等人，科学转化医学，2013，5(177)。另见wo2014031687、us8,339,645、us7,446,179、us2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282。嵌合受体(如car)通常包括细胞外抗原结合结构域，如抗体分子的一部分，通常是抗体的可变重(vh)链区和/或可变轻(vl)链区，例如，scfv抗体片段。在一些实施方式中，受体靶向的抗原是多肽。在一些实施方式中，其是碳水化合物或其他分子。在一些实施方式中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病状的细胞(例如，肿瘤或病原性细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方式中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。在一些实施方式中，受体(例如，car)靶向的抗原包括孤儿酪氨酸激酶受体ror1，tegfr，her2，ll-cam，cd19，cd20，cd22，间皮素，cea和乙型肝炎表面抗原，叶酸受体抗体，cd23，cd24，cd30，cd33，cd38，cd276，cd44，egfr，egp-2，egp-4，epha2，erbb2、3或4，fbp，胎儿乙酰胆碱受体，gd2，gd3，hmw-maa，il-22r-α，il-13r-α2，kdr，κ轻链，lewisy，l1细胞粘附分子，mage-a1，间皮素，muc1，muc16，psca，nkg2d配体，ny-eso-1，mart-1，gp100，瘤胎抗原，tag72，vegf-r2，癌胚抗原(cea)，前列腺特异抗原，psma，her2/neu，雌激素受体，孕激素受体，ephrinb2，cd123，c-met，gd-2和magea3，ce7，wilms肿瘤1(wt-1)，细胞周期蛋白(如细胞周期蛋白a1(ccna1))，和/或生物素化分子，和/或hiv、hcv、hbv或其他病原体表达的分子。在一些实施方式中，重组受体(例如，car)与独立地选自以下的一种或多种抗原特异性结合：rorl、her2、ll-cam、cd19、cd20、cd22、cea、乙型肝炎表面抗原、叶酸受体抗体、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd276、cd44、egfr、egp-2、egp-4、epha2、erbb2、erbb3、erbb4、fbp、胎儿乙酰胆碱受体、gd2、gd3、hmw-maa、il-22r-α、il-13r-α2、kdr、κ轻链、lewisy、l1细胞粘附分子(cd171)、mage-a1、间皮素、muc1、muc16、psca、nkg2d配体、ny-eso-1、mart-1、gp100、瘤胎抗原、tag72、vegf-r2、癌胚抗原(cea)、前列腺特异性抗原、psma、雌激素受体、孕激素受体、ephrinb2、cd123、cs-1、c-met、gd-2、magea3、ce7、wilms肿瘤1(wt-1)、细胞周期蛋白a1(ccna1)、bcma和白介素12。在一些实施方式中，重组受体(例如，car)与cd19、bcma、整联蛋白αvβ6、muc1、egfrviii、her2、egfr、gd2和/或间皮素特异性结合。在一些实施方式中，重组受体(例如，car)结合病原体特异性抗原。在一些实施方式中，重组受体(例如，car)对病毒抗原(如hiv、hcv、hbv等)、细菌抗原和/或寄生虫抗原具有特异性。在一些实施方式中，重组受体(例如，car)的抗体部分进一步包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分，如铰链区(例如，igg4铰链区)，和/或ch1/cl和/或fc区。在一些实施方式中，恒定区或部分是人igg，如igg4或igg1。在一些实施方式中，恒定区的部分用作抗原识别组分(例如，scfv)和跨膜结构域之间的间隔区。与不存在间隔子相比，间隔子可以具有在抗原结合后提供增加细胞应答性的长度。示例性间隔子(例如，铰链区)包括国际专利申请公开号wo2014031687中描述的那些间隔子。在一些实施例中，间隔子的长度为或约为12个氨基酸，或长度为不超过12个氨基酸。示例性间隔子包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸，并包括任何所列范围的端点之间的任何整数的那些间隔子。在一些实施方式中，间隔子具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔子包括单独的igg4铰链、连接至ch2和ch3结构域的igg4铰链或连接至ch3结构域的igg4铰链。该抗原识别结构域通常与一个或多个细胞内信号传导组分相连，如在car的情况下，通过抗原受体复合物(如tcr复合物)模拟激活的信号传导组分，以及可选的相关共刺激信号，和/或通过另一细胞表面受体的信号。因此，在一些实施方式中，抗原结合组分(例如，抗体)连接至一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一个实施方式中，使用天然与受体(例如，car)中的结构域中的一个相关的跨膜结构域。在某些情况下，跨膜结构域通过氨基酸取代进行选择或修饰，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一些实施方式中，跨膜结构域源自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，在一些实施方式中，该结构域源自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下的区域(即，至少包括其跨膜区域)：t细胞受体的α、β或ζ链，cd28，cd3ε，cd45，cd4，cd5，cds，cd9，cd16，cd22，cd33，cd37，cd64，cd80，cd86，cd134，cd137，cd154。可选地，在一些实施方式中，跨膜结构域是合成的。在一些实施方式中，合成的跨膜结构域主要包括疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方式中，在合成的跨膜结构域的每个末端可见苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方式中，通过连接子、间隔子和/或跨膜结构域进行连接。在细胞内信号传导结构域中的是那些通过天然抗原受体模拟或近似的信号(例如，cd3信号)、通过这种受体与共刺激受体结合的信号(例如，cd3/cd28信号)和/或仅通过共刺激受体的信号的结构域。在一些实施方式中，存在短的寡肽或多肽连接子，例如，长度为2至10个氨基酸的连接子，如含有甘氨酸和丝氨酸的连接子，例如，甘氨酸-丝氨酸双峰，并在car的跨膜结构域和细胞质信号结构域之间形成连接。受体(例如，car)通常包括至少一种细胞内信号传导组分。在一些实施方式中，受体包括tcr复合物的细胞内组分，如介导t细胞激活和细胞毒性的tcrcd3链，例如，cd3ζ链。因此，在一些实施方式中，抗原结合部分与一个或多个细胞信号传导模块连接。在一些实施方式中，细胞信号传导模块包括cd3跨膜结构域、cd3细胞内信号传导结构域和/或其他cd跨膜结构域。在一些实施方式中，受体(例如，car)进一步包括一种或多种另外分子的一部分，所述分子如fc受体γ、cd8、cd4、cd25或cd16。例如，在一些实施方式中，car或其他嵌合受体包括在cd3-ζ或fc受体γ与cd8、cd4、cd25或cd16之间的嵌合分子。在一些实施方式中，在连接car或其他嵌合受体后，该受体的细胞质结构域或细胞内信号传导结构域激活至少一种正常效应子功能或免疫细胞应答，例如，t细胞经工程化以表达car。例如，在某些情况下，car诱导t细胞的功能，如溶细胞活性或t辅助活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方式中，例如，如果抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导域的截短部分转导效应子功能信号，则使用它来代替完整的免疫刺激链。在一些实施方式中，该一个或多个细胞内信号传导结构域包括t细胞受体(tcr)的细胞质序列，并且在一些实施方式中还包括在自然情况下与此类受体协同作用以在抗原受体参与后启动信号转导的共受体的细胞质序列。在天然tcr的情况下，完全激活通常不仅需要通过tcr进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方式中，为了促进完全激活，在car中还包括用于产生次级或共刺激信号的组分。在其他实施方式中，car不包括用于产生共刺激信号的组分。在一些实施方式中，另外的car在同一细胞中表达，并提供用于产生次级或共刺激信号的组分。在一些实施方式中，t细胞激活被描述为由两类细胞质信号传导序列介导：通过tcr启动抗原依赖性主要激活的细胞质信号传导序列(主要细胞质信号传导序列)，和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的细胞质信号传导序列(次级细胞质信号传导序列)。在一些实施方式中，car包括该类信号传导组分中的一者或二者。在一些实施方式中，car包括调节tcr复合物的主要激活的主要细胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的主要细胞质信号传导序列可能包含信号传导基序，这些基序被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam。包含itam的主要细胞质信号序列的实例包括源自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cds、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的序列。在一些实施方式中，car中的细胞质信号传导分子包含细胞质信号传导结构域，其部分或源自cd3ζ的序列。在一些实施方式中，car包括共刺激受体的信号传导结构域和/或跨膜部分，如cd28、4-1bb、ox40、dap10和icos。在一些实施方式中，相同car包括激活和共刺激组分。在一些实施方式中，激活结构域包括在一个car中，而共刺激组分由识别另一种抗原的另一car提供。在一些实施方式中，car包括激活或刺激性car、共刺激性car，二者均在同一细胞上表达(参见wo2014/055668)。在一些实施方式中，细胞包括一种或多种刺激性或激活性car和/或共刺激性car。在一些实施方式中，细胞进一步包括抑制性car(icar，参见fedorov等人,科学转化医学,5(215)(12月,2013))，如识别与疾病或病状相关和/或对疾病或病状具有特异性的抗原以外的抗原的car，从而通过抑制性car与其配体的结合以减少或抑制通过靶向疾病的car传递的激活信号，例如，以减少脱靶效应。在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括连接至cd3(例如，cd3-ζ)细胞内结构域的cd28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括连接至cd3ζ细胞内结构域的嵌合cd28和cd137(4-1bb，tnfrsf9)共刺激结构域。在一些实施方式中，car包括细胞质部分中的一个或多个(例如，两个或多个)共刺激结构域和一个激活结构域(例如，主要激活结构域)。示例性car包括cd3-ζ、cd28和4-1bb的细胞内组分。在一些实施方式中，car或其他抗原受体进一步包括标志物，如细胞表面标志物，其可以用于确认细胞的转导或工程化以表达受体，如细胞表面受体的截短形式，如截短的egfr(tegfr)。在一些实施方式中，除了用作基因工程化的标志物外，该标志物不具有治疗功能和/或不产生作用，例如，用于选择成功工程化的细胞。在其他实施方式中，标志物可以是治疗分子或以其他方式发挥某些所需作用的分子，如体内待遇到的细胞的配体，例如共刺激或免疫检查点分子，以在过继转移和遇到配体时增强和/或抑制细胞应答。car可以称为第一代、第二代和/或第三代car。在一些实施方式中，第一代car是在抗原结合后仅提供cd3链诱导信号的car；在一些实施方式中，第二代car是提供此类信号和共刺激信号的car，如包括来自共刺激受体(如cd28或cd137)的细胞内信号传导结构域的car；在一些实施方式中，第三代car是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的car。在一些实施方式中，嵌合抗原受体包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些实施方式中，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，抗体或片段包括scfv，并且细胞内结构域包含itam。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括cd3-ζ链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方式中，嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域包含cd28的跨膜部分。在一些实施方式中，嵌合抗原受体包含t细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些实施方式中，t细胞共刺激分子是cd28或4-1bb。术语“多肽”和“蛋白”可以互换使用，是指氨基酸残基的聚合物，并且最小长度不限。包括提供的受体和其他多肽(例如，连接子或肽)的多肽可以包括氨基酸残基，所述氨基酸残基包括天然和/或非天然氨基酸残基。该术语还包括多肽的后表达修饰，例如，糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。在一些实施方式中，多肽可以包含相对于天然或天然序列的修饰，只要蛋白保持预期活性即可。这些修饰可能是有意的，如通过定点诱变，或者是偶然的，如通过产生蛋白的宿主突变或由于pcr扩增引起的错误。在一些实施方式中，基因工程化抗原受体包括从天然存在的t细胞克隆的重组t细胞受体(tcr)和/或tcr。在一些实施方式中，从患者身上识别、分离出一个用于靶抗原(例如，癌症抗原)的高亲和力t细胞克隆，并将其引入细胞中。在一些实施方式中，已经在经人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或hla)工程化的转基因小鼠中产生了用于靶抗原的tcr克隆。参见，例如，肿瘤抗原(参见，例如，parkhurst等人，(2009)临床癌症研究15:169-180andcohen等人，(2005)免疫学175:5799-5808)。在一些实施方式中，噬菌体展示用于分离针对靶抗原的tcr(参见，例如，varela-rohena等人，(2008)自然医学14:1390-1395andli(2005)自然生物技术23:349-354)。在一些实施方式中，在获得t细胞克隆之后，分离tcrα和β链并将其克隆到基因表达载体中。在一些实施方式中，tcrα和β基因通过小核糖核酸病毒2a核糖体跳跃肽连接，使得两条链均被共表达。在一些实施方式中，tcr的遗传转移通过逆转录病毒或慢病毒载体或通过转座子完成(参见，例如，baum等人，(2006)分子治疗：美国基因疗法学会杂志。13：1050-1063；frecha等人，(2010)分子治疗：美国基因疗法学会杂志。18：1748-1757；和hackett等人，(2010)分子治疗：美国基因疗法学会杂志。18:674-683)。crispr/cas9系统多种crispr/cas9系统可用于诱导基因破坏，如本文免疫细胞中hpk-1基因的基因敲除。通常，将包括cas9分子和grna的试剂引入免疫细胞，该grna具有与hpk-1基因的靶结构域互补、结合、识别或杂交的靶向结构域(例如，在第一或第二外显子中)或者一种或多种编码cas9和grna的多核苷酸。在一些实施方式中，引入免疫细胞的试剂是或包括cas9和grna的核糖核蛋白(rnp)复合物(cas9/grnarnp)，其包含hpk-1靶向的靶向结构域。在一些实施方式中，引入包括在体外将试剂或其部分与免疫细胞接触，这可以包括将细胞和试剂培养或孵育24、36或48小时或者3、4、5、6、7或8天或者更长时间。在多种实施方式中，可以例如通过电穿孔将cas9和grna或编码多核苷酸直接引入细胞。在一些实施方式中，在将试剂与细胞接触之前、期间或之后，和/或在进行递送(例如，电穿孔)之前、期间或之后，可以在细胞因子、刺激剂和/或能够诱导免疫细胞(例如，t细胞)增殖的试剂存在下孵育细胞。在一些实施方式中，至少一部分孵育是在刺激剂的存在下，所述刺激剂是或包括cd3的特异性抗体，cd28和/或细胞因子的特异性抗体。在一些实施方式中，至少一部分孵育是在细胞因子(如一种il-2、il-7和il-15)的存在下进行。在一些实施方式中，孵育在电穿孔之前或之后进行8天，如进行24小时、36小时或48小时或者3、4、5、6、7或8天或更长时间。在一些实施方式中，在刺激剂(例如，抗cd3/抗cd28)和/或细胞因子(例如，il-2、il-7和/或il-15)存在下的孵育在电穿孔前进行24小时、25小时或48小时。grna在一些实施方式中，引入细胞的试剂包括靶向hpk-1基因座区域的grna或编码该grna的核酸。在一些实施方式中，grna分子可以是单分子(具有单个rna分子)，有时在本文中称为“嵌合的”grna，或者可以是模块化的(包括一个以上，并且通常包括两个单独的rna分子)。在一些实施方式中，grna是嵌合grna，其包括5'至3'：与靶核酸互补的靶向结构域，如来自hpk-1基因的序列(示例性序列在seqidno：16和17中提供；另见ncbi登录号：nm_007181和nm_001042600))，第一互补结构域；连接结构域；第二互补结构域(与第一互补结构域互补)；近端结构域；和可选的尾结构域。在一些实施方式中，grna是包括第一链和第二链的模块化grna。在这些情况下，第一链优选包括5'至3'：靶向结构域(与靶核酸互补，如来自hpk-1基因的序列(示例性序列在seqidnos：16和17中提供；另见ncbi登录号：nm_007181和nm_001042600)和第一互补结构域。第二链通常包括5'至3'：可选地5'延伸结构域；第二互补结构域；近端结构域；以及可选的尾结构域。grna的靶向结构域可以包括与靶核酸(例如，hpk-1基因，如第一或第二外显子)上的靶序列互补(例如，至少80、85、90、95、98或99％互补，例如，完全互补)的核苷酸序列。包括靶序列的靶核酸的链在本文中称为靶核酸的“互补链”。例如，可在fuy等人,自然生物技术2014(doi:10.1038/nbt.2808)和sternbergsh等人,自然2014(doi:10.1038/naturel3011)中发现有关靶向结构域的选择指南。靶向结构域是rna分子的一部分，因此将包括碱基尿嘧啶(u)，而任何编码grna分子的dna将包括碱基胸腺嘧啶(t)。尽管不希望受到理论的束缚，但在一个实施方式中，认为靶向结构域与靶序列的互补性有助于grna分子/cas9分子复合物与靶核酸的相互作用的特异性。应当理解，在靶向结构域和靶序列对中，靶向结构域中的尿嘧啶碱基将与靶序列中的腺嘌呤碱基配对。在一个实施方式中，靶向结构域的长度为5至50个核苷酸。与靶向结构域互补的靶核酸的链在本文中称为互补链。该结构域的一些或所有核苷酸可以具有修饰，例如，使其不易降解、改善生物相容性等。作为非限制性实例，靶向结构域的骨架可以经硫代磷酸酯修饰，或其他修饰。在一些情况下，靶向结构域的核苷酸可以包括2'修饰，例如，2-乙酰化，例如，2'甲基化，或其他修饰。在多种实施方式中，本文grna的靶向结构域的长度为16-26个核苷酸(即，其长度为16个核苷酸或长度为17个核苷酸，或长度为18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸)。在一些实施方式中，靶序列(靶核酸)位于hpk-1基因座或在其附近，如seqidno：16和17中hpk-1编码序列的任何部分。在一些实施方式中，与靶向结构域互补的靶核酸位于目的基因(本文为hpk-1基因)的早期编码区。靶向早期编码区可用于敲除(即消除其表达)目的基因(如hpk-1基因)。在一些实施方式中，目的基因(例如，hpk-1基因)的早期编码区包括紧接起始密码子(例如，atg)之后，或起始密码子的500bp内(例如，小于500bp、450bp、400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp、40bp、30bp、20bp或10bp)的序列。在具体实施例中，靶核酸在起始密码子的200bp、150bp、100bp、50bp、40bp、30bp、20bp或10bp之内。在一些实施例中，靶核酸位于hpk-1基因的第一或第二外显子中。在一些实施例中，grna的靶向结构域与靶核酸(如hpk-1基因座中的靶核酸)上的靶序列互补，例如，至少80、85、90、95、98或99％互补，例如，完全互补。在一些实施方式中，用于敲除或敲低hpk-1的靶结构域是或包括选自seqidno：1和11-15中的任一序列。靶结构域序列人hpk-1基因的定位seqidno：1:gacctggtggcactgaaga第二外显子seqidno：11gctcgagacaaggtgtcag第二外显子seqidno：12aaggtgtcaggggacctgg第二外显子seqidno：13accactatgacctgctacag第一外显子seqidno：14gacctgctacagcggctggg第一外显子seqidno：15gctgggtggcggcacgtatg第一外显子在一些实施方式中，grna的靶向结构域与选自seqidnos：1和11-15的靶序列完全互补的序列相同或差异不超过1、2或3个核苷酸。cas9在一些实施方式中，所述试剂可以包括cas9分子或编码cas9的核酸。在一些实施方式中，所述试剂可以包括cas9/grna分子复合物(例如，由任一本文grna与任一本文cas9形成)，或者编码cas9和grna的一个或多个核酸分子。例如，在一些实施方式中，cas9蛋白和grna可以例如以约10：1至约1：10的比例(按质量计，cas9与grna的比例)被分离和孵育以形成grna/cas9复合物，然后可以例如通过电穿孔将其递送进入免疫细胞。通常，用于基因破坏的grna/cas9复合物的量可以是约1-100μg/1x106个细胞。如本领域技术人员所理解的，cas9分子或cas9多肽是可以与向导rna(grna)分子相互作用并与grna分子协同作用而定位于包括靶结构域和pam序列(例如，化脓链球菌为nggpam，金黄色葡萄球菌为nngrr(例如，nngrrt或nngrrv)，脑膜炎奈瑟氏菌为nnnngatt或nnnngcttpam)的位点的多肽。多个种属的cas9分子可用于本文所述方法和组合物中。在一些实施方式中，cas9分子是化脓链球菌、金黄色葡萄球菌或脑膜炎奈瑟球菌cas9。非限制性可用的cas9分子包括源自以下种属：化脓链球菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟球菌、嗜热链球菌、燕麦食酸菌、胸膜肺炎放线杆菌、琥珀酸放线杆菌、猪放线杆菌、放线菌属、脱氮嗜脂环物菌、少食氨基单胞菌、蜡样芽孢杆菌、史氏芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、拟杆菌属、海洋芽殖小小梨形菌、慢生根瘤菌、侧孢短芽孢杆菌、大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、暂定种谱尼螺杆菌、解纤维梭菌、产气荚膜梭菌、拥挤棒状杆菌白喉棒状杆菌、马氏棒状杆菌、柴氏海洋玫瑰杆菌、细长真杆菌、γ-变形杆菌、重氮营养葡糖酸醋杆菌、副流感嗜血杆菌、生痰嗜血杆菌、加拿大螺杆菌、同性恋螺杆菌、鼬鼠螺杆菌、多营养泥杆菌、金氏金菌、卷曲乳杆菌、伊氏李斯特菌、单核细胞增生李斯特菌、李斯特氏菌科细菌、甲基孢囊菌属、甲烷氧化菌、羞怯动弯杆菌、杆状奈瑟球菌、灰色奈瑟球菌、浅黄色奈瑟球菌、乳糖奈瑟球菌、脑膜炎奈瑟球菌、奈瑟球菌属、瓦茨瓦尔西奈瑟球菌、亚硝化单胞菌属、食清洁剂细小棒菌、多杀巴氏杆菌、琥珀酸考拉杆菌、蒲桃雷尔氏菌、沼泽红假单胞菌、小红卵菌属、米氏西蒙斯氏菌、鞘氨醇单胞菌属、葡萄园芽孢乳杆菌、金黄色葡萄球菌、路邓葡萄球菌、链球菌属、罕见小球菌属、运动替斯崔纳菌、密螺旋体属或爱胜蚓蚯蚓肾杆菌。在一些实施方式中，用于本文方法的cas9分子是野生型cas9分子。通常，野生型cas9分子切割靶核酸分子的两条链。在一些实施方式中，还可以使用具有改变的核酸酶切割特性(或其他特性)的修饰cas9分子和cas9多肽，例如，切口酶，或缺乏切割靶核酸的能力。对于哺乳动物表达，在一些实施方式中，可以将细菌cas9cdna进行密码子优化，例如，优化为人源化cas9cdna。示例性天然存在的cas9分子如chylinski等人,rna生物学201310:5,727-737所述。此类cas9分子包括簇1-78细菌家族的cas9分子。示例性的天然存在的cas9分子包括簇1细菌家族的cas9分子。实例包括以下的cas9分子：化脓链球菌(例如，菌株sf370、mgas10270、mgas10750、mgas2096、mgas315、mgas5005、mgas6180、mgas9429、nz131和ssi-1)，嗜热链球菌(例如，菌株lmd-9)，假豕链球菌(例如，菌株spin20026)，变形链球菌(例如，菌株ua159、nn2025)，猕猴链球菌(例如，菌株nctc11558)，解没食子酸链球菌(例如，菌株ucn34、atccbaa-2069)，马链球菌(例如，菌株atcc9812、mgcs124)，停乳链球菌(例如菌株ggs124)，牛链球菌(例如，菌株atcc700338)，咽峡炎链球菌(例如，菌株f0211)，无乳链球菌(例如，菌株nem316、a909)，单核细胞增生李斯特菌(例如，菌株f6854)，无害李斯特菌(例如，菌株clipl1262)，意大利肠球菌(例如，菌株dsm15952)或粪肠球菌(例如，菌株1,231,408)。其他示例性cas9分子是脑膜炎奈瑟球菌的cas9分子(hou等人,美国国家科学院院刊早期版2013,1-6)。在一些实施方式中，可以通过掺入可以促进cas9进入人免疫细胞的细胞核中的一个或多个人序列，如核定位序列(例如，插入至cas9分子的c端和n端的一者或二者)以修饰合适的cas9分子。核定位信号或序列(nls)是“标记”蛋白以通过核转运进入细胞核的氨基酸序列。通常，该信号由暴露于蛋白表面的一个或多个带正电荷的赖氨酸或精氨酸的短序列组成。不同的核定位蛋白可能共享相同的nls。通常，通过引入此类nls以维持cas9细胞核的活性，如此其可以为nhej或hdr修复产生双链断裂。在一些实施方式中，为了促进在哺乳动物细胞(如人细胞)中的表达，通常可以使用密码子优化的cas9cdna。此类“人源化cas9”的实例是已知的，例如，如chang,n等人,细胞研究23:465-472(2013)所述，其内容通过引用以其整体并入本文，包括人源化、密码子优化的cas9cdna的序列及其中报道的蛋白序列。其他nls也可能适用于促进cas9进入细胞核，例如，在us8,795,965中已有报道。核酸、载体和递送通常，本文hpk-1基因的基因破坏可以通过将诱导或能够诱导hpk-1基因破坏的试剂引入免疫细胞中来实现，随后进行孵育、培养、扩增和/或选择含有基因破坏(例如，基因敲除)的细胞。可以通过本领域技术人员已知的不同方法将用于破坏hpk-1基因的试剂递送至免疫细胞中。在一些实施方式中，所述试剂可以包括一种或多种分子，所述分子是、包括或编码反义分子、sirna、shrna、mirna、基因编辑核酸酶、锌指核酸酶蛋白(zfn)、tal效应子核酸酶(talen)或crispr-cas9组合，所述crispr-cas9组合特异性结合、识别或杂交hpk-1基因。在一些实施方式中，此类试剂可以例如通过电穿孔、脂质体或纳米颗粒等直接递送至免疫细胞。在一些实施方式中，可以将编码一种或多种分子的核酸分子递送至免疫细胞中。在一些实施方式中，可以通过本领域公知的方法将此类核酸分子或其复合物引入细胞中，如t细胞。此类方法包括但不限于以重组病毒载体(例如，逆转录病毒、慢病毒、腺病毒)，脂质体或纳米颗粒的形式引入。在一些实施方式中，方法可以包括显微注射、电穿孔、粒子轰击、磷酸钙转染、细胞压缩、挤压。在一些实施方式中，考虑到在细胞中表达，多核苷酸可以包括在载体中，更具体地包括在质粒或病毒中。在一些实施方式中，载体可以是质粒或病毒载体，如逆转录病毒载体、γ-逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关载体，其可以通过公知的方法被引入靶细胞(例如，本文的免疫细胞或用于产生grna的细胞，用于引入到免疫细胞中)和被表达。可以通过多种方法，通常在体外或离体，将本文的grna/cas9系统引入靶细胞。例如，在一些实施方式中，编码cas9分子和/或grna分子的dna可以通过本领域已知的方法，例如，通过载体(例如，病毒或非病毒载体)、基于非载体的方法(例如，使用裸露的dna或dna复合物)或其组合递送至细胞中。在一些实施方式中，可以通过载体(例如，病毒载体/病毒或质粒)递送编码cas9和/或grna的dna。载体可以包括编码cas9分子和/或grna分子的序列。在一些实施方式中，载体可以进一步包括调节/控制元件，如启动子，例如，u6或t7启动子。在一些实施方式中，载体(例如，质粒载体)包括编码本文grna分子的序列，例如，包括与hpk-1基因的靶结构域(例如，hpk-1基因的至少一个外显子，如第一或第二外显子，例如，seqidno：1和11-15)互补(例如，至少80、85、90、95、98或99％互补或完全互补)的靶向结构域的grna。在一些实施方式中，载体(例如，质粒载体)包括编码grna的序列，所述grna包括与选自seqidnos：1和11-15的靶序列完全互补的序列相同或差异不超过1、2或3个核苷酸的靶向结构域。在一些实施方式中，载体是质粒载体，其包括seqidno：3和4所示的序列。在一些实施方式中，质粒载体是puc57kan-t7-grna。在一些实施方式中，载体或递送溶剂是病毒载体(例如，用于产生重组病毒)。在一些实施方式中，病毒是dna病毒(例如，dsdna或ssdna病毒)。在一些实施方式中，所述病毒是rna病毒(例如，ssrna病毒)。示例性病毒载体/病毒包括，例如，逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(aav)、牛痘病毒、痘病毒和单纯疱疹病毒。在一些实施方式中，病毒载体可以具有复制能力。在一些实施方式中，病毒载体可以具有复制缺陷。在一些实施方式中，可以制备和分离grna和cas9蛋白，然后例如通过电穿孔将其引入靶细胞。例如，在一些实施方式中，本文编码grna的核酸分子和/或载体可以用于制备grna。然后可以分离和/或纯化grna以递送至本文的免疫细胞中。grna可以与cas9蛋白一起递送至免疫细胞中，例如，作为grna/cas9复合物。在一些实施方式中，可以将grna与cas9蛋白单独递送至免疫细胞中，其可以作为单独的蛋白或编码cas9蛋白的核酸/载体被引入细胞中。在一些实施方式中，引入免疫细胞的试剂是或包括cas9和grna的核糖核蛋白(rnp)复合物(cas9/grnarnp)，其包含hpk-1-靶向的靶向结构域。在一些实施方式中，引入包括在体外将试剂或其部分与免疫细胞接触，这可以包括将细胞和试剂培养或孵育24、36或48小时或者3、4、5、6、7或8天或更长时间。在多种实施方式中，例如，通过电穿孔可以将cas9和grna或编码多核苷酸直接引入细胞。在一些实施方式中，在将试剂与细胞接触之前、期间或之后，和/或在进行递送(例如，电穿孔)之前、期间或之后，可以在细胞因子、刺激剂和试剂存在下孵育细胞，所述试剂能够诱导免疫细胞(例如，t细胞)增殖。在一些实施方式中，至少一部分孵育是在刺激剂的存在下进行的，所述刺激剂是或包括cd3地特异性抗体、cd28和/或细胞因子的特异性抗体。在一些实施方式中，至少一部分孵育是在细胞因子(例如，一种il-2、il-7和il-15)的存在下进行的。在一些实施方式中，孵育在电穿孔之前或之后进行8天，如进行24小时、36小时或48小时或者3、4、5、6、7或8天或更长时间。在一些实施方式中，在刺激剂(例如，抗cd3/抗cd28)和/或细胞因子(例如，il-2、il-7和/或il-15)存在下孵育在电穿孔之前进行24小时、25小时或48小时。递送试剂(如grna和cas9蛋白)的其他方法包括本领域已知的方法。在一些实施方式中，本文的免疫细胞进一步包括重组受体，并且试剂(例如，grna/cas9复合物)的引入可以与编码重组受体(如本文所述的car)的核酸或其产物的引入同时或依次进行。在一些实施方式中，可以使用多种公知的用于评估细胞中基因表达的测定法中的任一种，例如，本文实施例部分中描述的方法，来评估基因在各时间点(例如，引入试剂后24至72小时)的基因(例如，hpk-1)的敲除程度，或者称为敲除效率。可以使用多种公知的用于评估细胞中基因表达的测定法中的任一种来评估基因在各时间点(例如，引入试剂后24至72小时)的基因敲低程度，如测定转录或蛋白表达或细胞表面表达水平的测定法。t细胞组合物和方法某些具体实施方式涉及t细胞，更具体地涉及具有car(例如，如本文所述)的t细胞。在一些实施方式中，t细胞具有hpk-1基因的基因破坏(例如基因敲除)。在一些实施方式中，t细胞包括含(a)本文的任一种或多种grna，或编码grna的多核苷酸或载体，(b)本文的任一种或多种cas9蛋白，或编码cas9蛋白的多核苷酸或载体，或(a)和(b)的组合。在一些实施方式中，t细胞包含本文的grna/cas9复合物。在一些实施方式中，t细胞组合物可以包括t细胞和用于敲除t细胞中hpk-1基因的工具。在一些实施方式中，t细胞是来自人癌症患者的原代细胞。在一些实施方式中，人患者患有选自以下的癌症：淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、b细胞急性淋巴细胞性白血病(b-all)、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、弥漫性大细胞淋巴瘤(dlcl)、多发性骨髓瘤、肾细胞癌(rcc)、神经母细胞瘤、直肠结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肉瘤、前列腺癌、肺癌、食道癌、肝细胞癌、胰腺癌、星形细胞瘤、间皮瘤、头颈癌、髓母细胞瘤及其组合。在一些实施方式中，敲除hpk-1基因的工具是grna/cas9复合物，其中所述grna包括与选自seqidnos：1和11-15的靶序列完全互补的序列相同或差异不超过1、2或3个核苷酸的靶向序列。在一些实施方式中，敲除hpk-1基因的工具是如本文实施例部分所示的grna/cas9复合物。在一些实施方式中，t细胞进一步包括重组受体，如本文所述car。在一些具体的实施方式中，本发明提供了t细胞群(例如，car-t细胞群)，其特征在于至少约50％、75％、80％、85％或90％的细胞包括细胞表面的重组受体(例如，如本文所述嵌合抗原受体)；和hpk-1基因敲除效率至少约为50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，例如，通过根据如实施例4中所述t7e1测定和/或实施例5中的westernblot法确定。在一些实施方式中，t细胞群(例如，car-t细胞群)的特征可以在于，通过流式细胞术确定，在细胞表面表达pd-1、tim-3和/或lag-3的细胞群中细胞的百分比低于对照细胞群中的细胞百分比；通过流式细胞术确定，在细胞表面表达膜联蛋白v的细胞群中的细胞百分比低于对照细胞群中的细胞百分比；和/或通过流式细胞术确定，在细胞表面表达cd107a的细胞群中的细胞百分比高于对照细胞群中的细胞百分比。鉴于本发明，本领域技术人员可以制备具有这些特征的t细胞群。如本领域技术人员的理解，术语“t细胞群”或“car-t细胞群”和本文的类似术语并不表示该细胞群不包含任何其他类型的细胞，尽管优选地，该细胞群应分别包含多数(例如，至少约50％)t细胞或car-t细胞。众所周知，除car-t细胞外，两种市售的car-t疗法kymriah(tisagenlecleucel)或yescarta(axicabtageneciloleucel)还可以包括nk细胞、nk-t细胞、b细胞等。在一些具体实施方式中，本发明提供了一种改变t细胞的方法，该方法包括将t细胞与诱导或能够诱导hpk1基因的基因破坏(例如，基因敲除)的试剂接触。在一些实施方式中，该方法包括(a)从人类患者(例如，如本文所述)获得t细胞；(b)在t细胞中引入诱导或能够诱导hpk-1基因破坏的试剂；和(c)用该试剂孵育并可选地扩增t细胞以提供hpk-1基因破坏的t细胞群。在一些实施方式中，可以在细胞因子(如il-2)或抗cd3和/或抗cd28抗体的存在下进行孵育。在一些实施方式中，该方法进一步包括(d)在t细胞中引入编码重组受体(如本文所述car或其产物)的核酸。合适的试剂包括本文所述任何试剂。在一些实施方式中，该方法包括将(a)本文任一种或多种grna或编码该grna的多核苷酸或载体，(b)本文一种或多种cas9蛋白或编码cas9蛋白的多核苷酸或载体，或(a)和(b)的组合引入t细胞中。在一些实施方式中，该方法包括将grna/cas9复合物引入t细胞中。在一些实施方式中，通过本文的方法产生的hpk-1基因破坏的t细胞群特征可以在于以下任何特征，如hpk-1基因敲除效率、衰竭标志物(pd-1、tim-3和/或lag-3)的表达、凋亡标记膜联蛋白v的表达、细胞毒性标志物cd107a的表达，如本文所述。例如，在一些实施方式中，hpk-1基因敲除效率可以为至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，例如，通过实施例4中所述t7e1测定和/或实施例5中的westernblot方法确定。t细胞或t细胞群可以包括已经从受试者(例如，人类受试者，例如患有癌症)获得的细胞，如原代细胞、从外周血单核细胞(pbmc)样品获得的细胞、未分级的t细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采血液成分术产物或白细胞分离术产物。在一些实施方式中，可以使用阳性或阴性选择和富集方法分离或选择t细胞以富集细胞群中的t细胞。在一些实施方式中，细胞群包含cd4 、cd8 或cd4 和cd8 t细胞。t细胞的其他合适类型包括本文所述任何t细胞。在一些实施方式中，t细胞是来自人类癌症患者的原代细胞。在一些实施方式中，人类患者患有选自以下的癌症：淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、b细胞急性淋巴细胞性白血病(b-all)、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、弥漫性大细胞淋巴瘤(dlcl)、多发性骨髓瘤、肾细胞癌(rcc)、神经母细胞瘤、直肠结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肉瘤、前列腺癌、肺癌、食道癌、肝细胞癌、胰腺癌、星形细胞瘤、间皮瘤、头颈癌、髓母细胞瘤及其组合。在一些实施方式中，可以同时或依次以任何顺序将编码重组受体(例如，基因工程化抗原受体)的核酸和用于破坏hpk-1基因的试剂(例如，本文的cas9/grnarnp)引入t细胞群中的细胞中。在一些实施方式中，在引入重组受体(例如，car)和试剂(例如，本文中的cas9/grnarnp)之后，在刺激细胞扩增和/或增殖的条件下培养或孵育细胞，例如，如本文所述。在一些实施方式中，本发明还提供了用于增强免疫细胞(如t细胞)在过继细胞疗法中的功能的方法，包括提供改善效率的方法，如通过增加给予的基因工程化(例如，car )细胞的活性和效力，同时保持随时间的持久性或暴露于转移的细胞。在一些实施方式中，该方法包括破坏免疫细胞中的hpk-1基因，例如，通过将诱导或能够诱导hpk-1基因的基因破坏(例如，基因敲除)的试剂引入免疫细胞中。在一些实施方式中，该方法包括将(a)本文的任一种或多种grna或编码grna的多核苷酸或载体，(b)本文的任一种或多种cas9蛋白，或编码cas9蛋白的多核苷酸或载体，或(a)和(b)的组合引入免疫细胞中。在一些实施方式中，该方法包括将本文的grna/cas9复合物引入免疫细胞中。在一些实施方式中，与某些可获得的方法相比，当受试者体内给药时，具有hpk-1基因破坏的免疫细胞，如表达car的t细胞，表现出增加的扩增和/或持久性。在一些实施方式中，本发明还提供了用于增强免疫细胞群(例如，t细胞群，如car-t细胞)的细胞毒性、抑制衰竭和/或增强脾脏和/或肿瘤中的浸润的方法，该方法包括将免疫细胞群与诱导或能够诱导hpk1基因的基因破坏(例如，基因敲除)的试剂接触。在一些实施方式中，该方法包括(a)从人类患者(例如，如本文所述)获得免疫细胞(例如，t细胞)群；(b)将诱导或能够诱导hpk-1基因破坏的试剂引入免疫细胞(例如，t细胞)群中；和(c)用所述试剂孵育并可选地扩增免疫细胞(例如，t细胞)，以提供与引入试剂之前的细胞群相比具有增强的细胞毒性、减少的衰竭和/或在脾脏和/或肿瘤中增强的浸润的hpk-1基因破坏的免疫细胞(例如，t细胞)群。在一些实施方式中，该方法进一步包括将编码重组受体(如本文所述car)或其产物的核酸引入免疫细胞(例如，t细胞)中。合适的试剂包括本文所述任何试剂。在一些实施方式中，该方法包括将(a)本文中的任一种或多种grna，或者编码grna的多核苷酸或载体，(b)本文中的任一种或多种cas9蛋白，或者编码cas9蛋白的多核苷酸或载体，或(a)和(b)的组合引入免疫细胞(例如，t细胞)中。在一些实施方式中，该方法包括将本文的grna/cas9复合物引入免疫细胞中。在一些实施方式中，通过本文的方法产生的hpk-1基因破坏的t细胞群特征可以在于以下任何特征，如hpk-1基因敲除效率，衰竭标志物(pd-1、tim-3和/或lag-3)的表达，凋亡标志物膜联蛋白v的表达，细胞毒性标志物cd107a的表达，如本文所述。例如，在一些实施方式中，hpk-1基因敲除效率可以为至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，例如，通过根据实施例4中所述t7e1测定的方法和/或实施例5中的westernblot方法确定。在一些实施方式中，免疫细胞群是car-t细胞群。在一些实施方式中，car-t群的特征在于至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞包括细胞表面的重组受体(例如，嵌合抗原受体，例如，如本文所述)。在一些实施方式中，该方法产生具有至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的hpk-1基因敲除效率的car-t细胞群，例如，通过根据实施例4中所述t7e1测定和/或实施例5中的westernblot方法测定。如本文所详述，出乎意料的是，通过破坏免疫细胞(如car-t细胞)中的hpk-1基因，免疫细胞表现出增强的细胞毒性、增加的持久性和减少的衰竭，和/或在脾脏和/或肿瘤中增强的浸润。当给药至受试者时，也已经在体内观察到这种作用。例如，在一项动物研究中，当与野生型car-t细胞或pd-1敲除的car-t细胞相比时，发现hpk-1敲除的car-t细胞以更高水平保留在治疗动物的血浆中。给药至受试者后，可以例如通过qpcr、流式细胞术测定或基于细胞的测定检测或定量给药细胞的持久性范围或程度。这进一步说明了与本文的组合物和方法有关的优势，例如，在过继免疫疗法中。如本领域技术人员根据本发明所理解的，本文的方法不限于任何特定免疫细胞或特定car。在一些实施方式中，还可以使用本文的方法修饰可商购的car-t细胞，例如，敲除hpk-1基因，以进一步改善其免疫治疗功能，如减少t细胞衰竭。例如，可以通过本文的方法修饰用于kymriah(tisagenlecleucel)或yescarta(axicabtageneciloleucel)的car-t细胞，以敲除hpk-1基因。如本文所讨论的，在这些实施方式中，引入用于hpk-1基因的基因修饰的试剂可以与引入编码用于kymriah或yescarta的cd19car的核酸同时或依次以任何顺序进行。例如，根据包装说明书，为了制备yescarta，收获患者自身的t细胞并通过逆转录病毒转导进行离体基因修饰以表达包括与cd28和cd3-ζ共刺激结构域相连的鼠抗cd19单链可变片段(scfv)的嵌合抗原受体(car)。抗cd19cart细胞被扩增并输回患者体内，在患者体内它们可以识别和消除表达cd19的靶细胞。更具体地，yescarta可以从患者的外周血单核细胞制备，这些细胞通过标准的白细胞分离术获得。单核细胞被t细胞富集，并在il-2存在下被抗cd3抗体激活，然后用含有抗cd19car转基因的无复制能力的逆转录病毒载体转导。转导的t细胞在细胞培养物中扩增、洗涤、配制成悬浮液并冷冻保存。该产品在放行前必须通过无菌检测才能作为冷冻悬浮液装入患者专用的输液袋中。kymriahtm(tisagenlecleucel)是一种cd19定向的基因修饰的自体t细胞免疫疗法，其由利用慢病毒载体进行基因修饰以编码抗cd19嵌合抗原受体(car)的自体t细胞组成。car由对cd19特异的鼠单链抗体片段(scfv)组成，随后是与4-1bb(cd137)和cd3ζ的细胞内信号传导结合域融合的cd8铰链和跨膜区域。kymriah可以从患者的外周血单核细胞中制备，这些细胞通过标准的白细胞分离术获得。单核细胞被t细胞富集，然后用含有抗cd19car转基因的慢病毒载体转导，并用抗cd3/cd28抗体包被的磁珠激活。转导的t细胞在细胞培养物中扩增、洗涤并配制成悬浮液，然后将其冷冻保存。该产品在放行前必须通过无菌检测才能作为冷冻悬浮液装入患者专用的输液袋中。该产品在给药前解冻。在一些实施方式中，用于kymriah(tisagenlecleucel)或yescarta(axicabtageneciloleucel)的car-t细胞可以通过引入可敲除hpk-1基因的试剂(例如，如本文所述，如grna/cas9)来进行修饰，试剂的引入与包含抗cd19car转基因的逆转录病毒载体的引入同时或依次进行。然后可以将获得的细胞在细胞培养物中扩增、洗涤和配制，其与制备kymriah或yescarta的过程相似。药物组合物和治疗方法修饰的免疫细胞(如car-t细胞)最近已被批准用于治疗某些癌症。例如，yescarta是一种cd19定向基因修饰的自体t细胞免疫治疗，适用于经过两线或多线系统治疗后复发或难治性大b细胞淋巴瘤的成年患者的治疗，包括未另作说明的弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤、高级b细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤引起的dlbcl。同样，kymriah是一种cd19定向基因修饰的自体t细胞免疫疗法，适用于治疗：患有难治性或者继发或晚期复发的b细胞前体急性淋巴细胞性白血病(all)的25岁患者；经过两线或更多线系统治疗后复发或难治性(r/r)大b细胞淋巴瘤的成年患者，包括未另作说明的弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、高级b细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤引起的dlbcl。如本文所讨论，基因破坏在免疫细胞(如car-t细胞)(如用于yescarta或kymriah)中的hpk-1基因可以进一步增强免疫治疗功能，如增加的细胞毒性和减少的衰竭。因此，本文还提供了药物组合物，其包括细胞、细胞群，例如通过本文的任何方法产生的细胞和细胞群，如用于过继免疫疗法(如用于治疗癌症)。药物组合物和制剂通常包括一种或多种可选的药学上可接受的载体或辅料。在一些实施方式中，该组合物包括至少一种其他治疗剂。术语“药物制剂”是指其形式为允许其中所含活性成分的生物活性有效的制剂，并且其不包含对给予制剂的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、辅料、稳定剂或防腐剂。载体如雷明顿药物科学第16版,osol,a.ed.(1980)所述。在一些实施方式中，载体的选择部分地由特定细胞和/或通过给药方法确定。合适的防腐剂包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些实施方式中，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以占组合物的约0.0001重量％至约2重量％的量存在。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些实施方式中，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以占组合物总量的约0.001重量％至约4重量％的量存在。制备可给药的药物组合物的方法是已知的。示例性方法在雷明顿：药学的科学与实践,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司；第21版(2005年5月1日)中有更详细的描述。在一些实施方式中，药物组合物包括有效治疗或预防疾病或病状的量的细胞，如治疗有效量或预防有效量。在一些实施方式中，通过定期评估治疗受试者以监测治疗或预防效率。可以通过单次推注细胞、多次推注细胞或连续输注细胞以递送所需剂量。可以使用标准给药技术、制剂和/或装置进行细胞和组合物给药。细胞给药可以是自体或异源的。例如，可以从一名受试者获得免疫应答细胞或祖细胞，并将其给药至相同受试者或不同的相容受试者。外周血来源的免疫应答细胞或其传代细胞(例如，体内、离体或体外来源)可以通过局部注射给药，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给药。当给药治疗组合物(例如，包含基因修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制为单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳剂)。在一些实施方式中，组合物以无菌液体制剂的形式提供，例如，等渗水溶液、悬浮液、乳剂、分散液或粘性组合物，其在某些实施方式中可以缓冲至选定的ph。可以通过将细胞掺入溶剂中制备无菌可注射溶液，如与合适的载体、稀释剂或辅料(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。所述组合物可以包含辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、ph缓冲剂、胶凝或增粘添加剂、防腐剂、矫味剂和/或着色剂，这取决于预期的给药途径和制剂。在一些实施方式中，可以参考标准文本以制备合适的制剂。可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的多种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)确保防微生物的作用。可以通过使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)延长可注射药物形式的吸收。用于体内给药的制剂通常是无菌的。无菌性容易例如，通过无菌滤膜过滤实现。在一些实施方式中，本发明进一步提供了用于将细胞和组合物给药至受试者(例如，人类患者)以治疗或预防疾病、病状和病症(包括癌症)的方法，例如，治疗方法。在一些实施方式中，例如，通过过继细胞疗法(如过继t细胞疗法)，将细胞、细胞群和组合物给药至患有特定疾病或病状的受试者或患者。在一些实施方式中，将通过本文的方法制备的细胞和组合物，如孵育和/或其他处理步骤后的car-t细胞和产生结束的组合物，给药至受试者，如患有或具有该疾病或病状风险的受试者。在一些实施方式中，因此，该方法例如通过减轻表达被工程化t细胞识别的抗原的癌症中的肿瘤负担来治疗例如改善疾病或病状的一种或多种症状。在一些实施方式中，该方法包括将治疗有效量的具有本文hpk-1基因破坏的免疫细胞或细胞组合物给药至有需要的受试者。在一些实施方式中，该方法包括(a)从需要治疗的受试者获得免疫细胞(例如，t细胞)；(b)在免疫细胞(例如t细胞)中引入诱导或能够诱导hpk-1基因破坏的试剂；(c)用所述试剂孵育并可选地扩增免疫细胞以提供hpk-1基因破坏的细胞群；和(d)将hpk-1基因破坏的细胞群给药至受试者。在一些实施方式中，该方法进一步包括(e)将编码重组受体(如本文所述car或其产物)的核酸引入免疫细胞(例如，t细胞)。(b)和(e)的引入步骤可以同时或依次以任何顺序进行。合适的试剂和重组受体包括本文所述的那些试剂和重组受体。用于过继细胞疗法的细胞给药方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继性t细胞疗法的方法如以下所述：例如，授予gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；授予rosenberg的美国专利号4,690,915；rosenberg(2011)自然评论临床肿瘤学8(10):577-85)。参见，例如，themeli等人，(2013)自然生物技术31(10):928-933；tsukahara等人，(2013)生物化学和生物物理研究通讯438(1):84-9；davila等人，(2013)plosone8(4):e61338。在一些实施方式中，通过自体转移进行细胞疗法，例如，过继性t细胞疗法，其中从待接受细胞疗法的受试者或从源自该受试者的样品中分离和/或制备细胞。因此，在一些实施方式中，所述细胞源自需要治疗的受试者(例如，患者)，并且在分离和处理后将所述细胞给药至同一受试者。在一些实施方式中，通过同种异体转移进行细胞疗法，例如，过继性t细胞疗法，其中从待接受或最终接受细胞治疗的受试者以外的受试者，例如，第一受试者，分离和/或制备细胞。在这些实施方式中，然后将细胞给药至相同种属的不同受试者，例如，第二受试者。在一些实施方式中，第一和第二受试者在遗传上相同。在一些实施方式中，第一和第二受试者在遗传上相似。在一些实施方式中，第二受试者表达与第一受试者相同的hla类别或超型。通过本文的方法治疗的合适疾病或病症包括肿瘤，所述肿瘤包括实体瘤、血液系统恶性肿瘤和黑色素瘤，以及感染性疾病，如感染病毒或其他病原体，例如，hiv、hcv、hbv、cmv和寄生虫疾病。在一些实施方式中，所述疾病或病状是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、赘生物或其他增生性疾病或病症。这些疾病包括但不限于所述疾病或病状是癌症或肿瘤，其可能是白血病、淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、急性淋巴细胞性白血病(all)、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性b细胞淋巴瘤、b细胞恶性肿瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑素瘤癌、骨癌、脑癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺腺癌、霍奇金淋巴瘤、子宫颈癌、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、尤因肉瘤、髓母细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤和/或间皮瘤。在一些实施方式中，所述疾病或病症与选自以下的抗原有关：孤儿酪氨酸激酶受体ror1，tegfr，her2，l1-cam，cd19，cd20，cd22，间皮素，cea和乙肝表面抗原，叶酸受体抗体，cd23，cd24，cd30，cd33，cd38，cd276，cd44，egfr，egp-2，egp-4，epha2，erbb2、3或4，fbp，胎儿乙酰胆碱e受体，gd2，gd3，hmw-maa，il-22r-α，il-13r-α2，kdr，κ轻链，lewisy，l1细胞粘附分子，mage-a1，间皮素，muc1，muc16，psca，nkg2d配体，ny-eso-1，mart-1，gp100，瘤胎抗原，ror1，tag72，vegf-r2，癌胚抗原(cea)，前列腺特异抗原，psma，her2/neu，雌激素受体，孕激素受体，ephrinb2，cd123，cs-1，c-met，gd-2和magea3和/或生物素化分子，和/或hiv、hcv、hbv或其他病原体表达的分子。例如，在一些实施方式中，所述疾病或病症可以与表达cd19、bcma、整联蛋白αvβ6、muc1、egfrviii、her2、egfr、gd2和/或间皮素的细胞相关。为了预防或治疗疾病，适当的剂量可能取决于待治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、是否出于预防或治疗目的、既往治疗、受试者的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的判断而进行细胞给药。在一些实施方式中，将组合物和细胞一次或通过一系列治疗适当地给予受试者。细胞可以通过任何合适的方式给药，例如，通过推注、注射，例如，静脉或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、筋膜下注射、球后注射、球周注射或后巩膜递送。在一些实施方式中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内给药，并且如果需要局部治疗，则通过病灶内给药。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一些实施方式中，将细胞作为联合治疗的一部分给药，例如与另一治疗干预同时或依次以任何顺序进行，另一治疗干预如抗体或工程化细胞或受体或试剂，如细胞毒性或治疗剂。在一些实施方式中，将细胞与一种或多种另外的治疗剂共同给药或与另一种治疗干预一起同时或以任何顺序依次给药。在某些情况下，将细胞与时间足够接近的另一种疗法共同给药，以使细胞群增强一种或多种其他治疗剂的作用，反之亦然。在一些实施方式中，细胞在一种或多种其他治疗剂之前给药。在一些实施方式中，细胞在一种或多种其他治疗剂之后给药。在一些实施方式中，一种或多种其他试剂包括细胞因子(如il-2)，例如，以增强持久性。在一些实施方式中，该方法包括化学治疗剂给药。在细胞给药后，在一些实施方式中，工程化细胞群的生物活性可以例如通过许多已知方法中的任一种来测量。评估的参数包括在体内例如通过成像或离体(例如，通过elisa或流式细胞术)工程化的或天然的t细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合。在某些实施方式中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适方法来测量，例如，kochenderfer等人,免疫治疗期刊,32(7):689-702(2009)，和herman等人免疫法杂志,285(1):25-40(2004)中描述的细胞毒性测定法。在某些实施方式中，通过测定一种或多种细胞因子的表达和/或分泌测量细胞的生物学活性，所述细胞因子如cd107a、ifnγ、il-2和tnf。在一些实施方式中，通过评估临床结果(如降低肿瘤负担或负荷)测量生物学活性。在某些实施方式中，以多种方式进一步修饰工程化细胞，从而提高其治疗或预防效率。例如，细胞群表达的工程化car或tcr可以直接或通过连接子间接偶联至靶向部分。将化合物(例如，car或tcr)偶联至靶向部分的实践是本领域已知的。参见，例如，wadwa等人,药物靶向杂志3:111(1995)，和美国专利5,087,616。定义如本文所用，术语“约”是指本
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技术人员容易知道的各自值的通常误差范围。本文中提及的“约”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的实施例。如本文所用，除非上下文另外明确指出，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数所指物。例如，“一个(a)”或“一个(an)”表示“至少一个”或“一个或多个”。在本发明全文中，所要求保护的主题的各种实施例以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对所要求保护的主题的范围的固定限制。因此，应认为范围的描述已经具体披露了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，在提供值的范围情况下，应理解，在该范围的上限和下限与所述范围内的任何其他所述值或居中值之间的每个居中值均包括在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且还包括在所要求保护的主题内，但要受所述范围内的任何明确排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，所要求保护的主题中还包括排除那些包括的限制中的一个或两个的范围。无论范围的广度如何，这均适用。为了简洁，如本文所用，当术语“至少约”，“约”等后面跟随有一系列数字时，应理解的是，这些数字中的每一个均以该术语开头。例如，至少约50％、60％、70％或80％应被理解为至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％。同样为了简洁，当从上下文中明显看出要使用相同的分母时，有时可以省略符号“％”。例如，当描述百分比时，约50、60、...、或90％应该理解为约50％、约60％、...、或约90％。如本文所用，当相对于氨基酸序列(参比多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”被定义为候选序列(例如，链霉亲和素突变蛋白)中氨基酸残基的百分比，在比对序列并引入缺口后，所述氨基酸残基与参比多肽序列中的氨基酸残基相同，如有必要，以获得最大的序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。为了确定氨基酸序列同一性百分比的目的，比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。如下进行两个序列之间的同源性或序列同一性的计算(术语在本文中可互换使用)。为了最佳比较目的，比对序列(例如，为了最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中引入缺口，而为了比较目的，可以忽略非同源序列)。使用gcg软件包中的gap程序将最佳比对确定为最佳评分，其中的blossum62评分矩阵的缺口罚分为12，缺口延伸罚分为4，移码缺口罚分为5。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置相同。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数目的函数。氨基酸取代可以包括用另一氨基酸替换多肽中的一个氨基酸。氨基酸通常可以根据以下常见的侧链特性进行分组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gin；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；(6)芳香族：trp、tyr、phe。非保守氨基酸取代将涉及将这些类别之一的成员交换为另一类别。如本文所用，“非同源末端连接”或“nhej”是指连接介导的修复和/或非模板介导的修复，包括，例如，经型nhej(cnhej)、替代性nhej(altnhej)、微同源性介导的末端连接(mmej)、单链退火(ssa)和依赖于合成的微同源性介导的末端连接(sd-mmej)。“grna分子”是指促进grna分子/cas9分子复合物特异性靶向或归巢至靶核酸的核酸，如细胞基因组dna上的基因座。如本文中关于分子修饰所使用的“替换(replacement)”或“被替换(replaced)”不需要过程限制，而仅指示存在替换实体。如本文所用，受试者包括任何活生物体，如人和其他哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类和非人类动物，包括农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。该术语包括但不限于哺乳动物(例如，人，其他灵长类动物，猪，啮齿动物(例如，小鼠和大鼠或仓鼠)，家兔，豚鼠，牛，马，猫，犬，绵羊和山羊)。在一个实施方式中，受试者是人。在其他实施方式中，受试者是家禽。如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物的任何混合物，包括细胞。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变化，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指完全或部分改善或减轻疾病或病状或病症，或与之相关的症状、不良反应或结果，或表型。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速度、改善或减轻疾病状态、以及缓解或改善预后。这些术语并不表示完全治愈疾病或完全消除对所有症状或结果的任何症状或影响。如本文所用，“预防(preventing)”包括针对可能易患该疾病但尚未确诊患有该疾病的受试者中疾病的发生或复发提供预防。在一些实施方式中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病发生或减慢疾病进展。如本文所用，“抑制(suppress)”功能或活性是与除目的病状或参数以外的其他相同病状相比，或者与另一病状相比，降低功能或活性。例如，与不存在细胞的情况下肿瘤生长速度相比，抑制肿瘤生长的细胞降低肿瘤生长的速度。在给药背景下，试剂(例如，药物制剂、细胞或组合物)的“有效量”是指在必要的剂量/量和时间段内有效达到所需结果的量，所述所需结果如治疗或预防结果。试剂(例如，药物制剂或细胞)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需治疗结果的量，所述所需治疗结果如用于疾病、病状或病症的治疗，和/或治疗的药代动力学或药效学作用。治疗有效量可以根据如疾病状态、受试者的年龄、性别和体重以及给药细胞群等因素而变化。在一些实施方式中，提供的方法包括以有效量(例如治疗有效量)进行细胞和/或组合物给药。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需的预防结果的量。通常但不是必须的，因为在疾病之前或疾病早期在受试者中使用预防剂量，所以预防有效量将小于治疗有效量。在较低的肿瘤负荷的情况下，在一些实施方式中，预防有效量将高于治疗有效量。如本文所用，当提及一种或多种特定细胞类型或细胞群时，“富集(enriching)”是指增加细胞类型或细胞群的数量或百分比，例如，与组合物中的细胞总数或体积相比，或相对于其他细胞类型，如通过基于细胞群或细胞表达的标志物的阳性选择，或基于待耗竭的细胞群或细胞上不存在的标志物进行阴性选择。该术语不需要从组合物中完全去除其他细胞、细胞类型或细胞群，并且不需要如此富集的细胞在富集组合物中出现，甚至接近100％。如本文所用，细胞或细胞群对特定标志物“呈阳性”的陈述是指特定标志物(通常是表面标志物)在细胞上或细胞内可检出的存在。当提及表面标志物时，该术语是指通过流式细胞术检出的表面表达的存在，例如，通过使用与标志物特异性结合的抗体染色并检测所述抗体，其中所述染色可以通过流式细胞术检出，其水平基本上高于在相同条件下用同种型匹配的对照或荧光减去一个(fmo)门控对照进行相同程序检测的染色和/或其水平与已知对标记物呈阳性的细胞水平基本相似，和/或其水平基本上高于已知对标记物呈阴性的细胞水平。如本文所用，细胞或细胞群对于特定标志物“呈阴性”的陈述是指在特定标志物(通常为表面标志物)的细胞上或细胞中不存在实质上可检出的存在。当提及表面标志物时，该术语是指不存在通过流式细胞术检出的表面表达，例如，通过使用与标志物特异性结合的抗体染色并检测所述抗体，其中通过流式细胞术未检出染色，其水平基本上高于在相同条件下用同种型匹配的对照或荧光减去一个(fmo)门控对照进行相同程序检测的染色，和/或其水平基本上低于已知对标志物呈阳性的细胞水平，和/或其水平与已知对标志物呈阴性的细胞水平基本相似。如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及掺入已引入其中的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够引导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号以及其他技术和科学术语或专业术语旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。在某些情况下，为了清楚和/或易于参考，在此定义了具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包括这些定义不应该被解释为表示与本领域通常理解的实质性区别。本申请中提及的所有出版物，包括专利文件、科学文章和数据库，出于所有目的通过引用将其整体并入本文，其程度与每个单独出版物通过引用各别地并入本文的程度相同。如果本文提出的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中提出的定义相反或不一致，则本文提出的定义优于通过引用并入本文的定义。示例性实施方式在一个实施方式中，本发明提供了一种基因修饰hpk1基因的方法，其中所述方法包括基因修饰hpk1基因，从而使hpk1蛋白的功能失活或使其活性降低。在各种实施方式中，本发明的方法操作简单、敲除效率高并有效增强t细胞的肿瘤杀伤活性。通过本发明的方法修饰的t细胞具有广阔的临床应用前景。本文的基因修饰包括基因敲除、部分基因缺失、基因替换和插入。在一些实施方式中，基因修饰包括基因修饰hpk1基因的第二外显子。在一些实施方式中，基因修饰包括使用基因编辑技术修饰hpk1基因。可以使用各种基因编辑技术。例如，在一些实施方式中，基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的dna同源重组技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；优选地，使用基于crispr/cas9的基因编辑技术进行基因修饰。在一些实施方式中，该方法包括使用靶向hpk1基因的grna敲除hpk1基因。例如，在一些实施方式中，grna靶向hpk1基因的第二外显子。通常将grna和cas9蛋白一起用于敲除hpk1基因。在一些实施方式中，该方法包括制备grna。在一些实施方式中，制备grna的方法包括：(1)构建grna负载质粒；(2)体外转录grna。在一些实施方式中，步骤(1)包括合成grna编码链和互补链，将编码链和互补链退火形成的双链dna插入puc57载体，并将其置于t7启动子的控制下以构建puc57kan-t7-grna。在一些实施方式中，步骤(2)包括纯化通过酶消化和测序鉴定的grna负载质粒puc57kan-t7-grna，使用t7rna体外转录试剂盒体外转录hpk1grna/hpk1grna，并纯化转录产物以获得grna。在一些实施方式中，使用t7rna体外转录试剂盒进行hpk1grna/hpk1grna的体外转录。在一些实施方式中，grna的双链dna模板序列如seqidno：3和seqidno：4所示：f:5′-tagggacctggtggcactgaaga-3′(seqidno：3)r:5′-aaactcttcagtgccaccaggtc-3′(seqidno：4)。在一些实施方式中，grna包括与序列gacctggtggcactgaaga的靶结构域互补的靶向结构域。在一些实施方式中，该方法包括基因修饰单核细胞的hpk1基因；优选地，所述单核细胞是人外周血单核细胞；更优选地，所述人外周血单核细胞更优选为t细胞、nk细胞或nkt细胞；更优选地，所述人外周血单核细胞是cd3 t细胞。最优选地，所述人外周血单核细胞进一步表达外源嵌合抗原受体。例如，在一些实施方式中，该方法包括：(1)制备靶向hpk1基因的grna；(2)制备cas9蛋白；(3)体外培养和扩增单核细胞；(4)将步骤(1)的grna和步骤(2)的cas9蛋白共转染至步骤(3)的单核细胞中。敲除效率可以通过本领域已知的方法或本文所述方法确定。在一些实施方式中，该方法进一步包括在步骤(4)中的共转染后，鉴定单核细胞中hpk1基因的敲除效率，优选地，通过pcr-酶消化和/或westernblot方法鉴定人外周血单核细胞中hpk1基因的敲除效率。在一些实施方式中，可以通过以下步骤鉴定单核细胞中hpk1基因的敲除效率：使用seqidno：7和seqidno：8所示的引物进行pcr扩增，对pcr产物进行热变性、退火和复性，然后进行t7核酸内切酶处理，并通过琼脂糖凝胶电泳鉴定切割效率；或者，通过以下步骤鉴定单核细胞中hpk1基因的敲除效率：提取单核细胞中的总蛋白，对其进行sds-page，转移至膜上，然后以抗hpk1抗体作为一抗进行westernblot。在一些实施方式中，该方法进一步包括步骤(5)：在步骤(4)中获得的grna和cas9蛋白共转染的单核细胞中表达人源嵌合抗原受体(car)。在一些实施方式中，所述人源嵌合抗原受体是car19、bcma、整联蛋白αvβ6、muc1、egfrviii、her2、egfr、gd2、间皮素。在一些实施方式中，本发明还提供了增强单核细胞的杀伤活性的方法或增加单核细胞的th1细胞因子分泌水平的方法。在一些实施方式中，本发明提供了用于增强外周血单核细胞的杀伤活性的方法。在一些实施方式中，该方法包括：(1)制备靶向hpk1的grna；(2)制备cas9蛋白；(3)体外培养和扩增人外周血单个核细胞；(4)将步骤(1)的grna和步骤(2)的cas9蛋白共转染到步骤(3)的人外周血单核细胞中。在本发明的增强外周血单核细胞的杀伤活性的方法中，优选地，所述人外周血单核细胞是t细胞、nk细胞、nkt细胞，更优选地，所述外周血单核细胞是cd3 t细胞。在本发明的增强外周血单核细胞杀伤活性的方法中，优选地，所述人外周血单核细胞进一步表达外源嵌合抗原受体。在本发明的增强外周血单核细胞杀伤活性的方法中，该方法进一步包括步骤(5)：在步骤(4)中获得的grna和cas9蛋白转染的cd3 人外周血单核细胞中表达人源car。优选地，所述人源嵌合抗原受体是cd19、bcma、整联蛋白αvβ6、muc1、egfrviii、her2、egfr、gd2、间皮素。在本发明的增强外周血单核细胞杀伤活性的方法中，其中步骤(4)进一步包括鉴定人外周血单核细胞中hpk1基因的敲除效率。在本发明的增强外周血单核细胞的杀伤活性的方法中，优选地，通过pcr-酶消化和/或westernblot方法鉴定人外周血单核细胞中hpk1基因的敲除效率。在本发明的增强外周血单核细胞杀伤活性的方法中，其中人外周血单核细胞中hpk1基因的敲除效率通过以下步骤鉴定：使用seqidno：7和seqidno：8所示引物进行pcr扩增。对pcr产物进行热变性、退火和复性，然后进行t7核酸内切酶处理，并通过琼脂糖凝胶电泳鉴定切割效率。在本发明的增强外周血单核细胞杀伤活性的方法中，其中通过以下步骤鉴定人外周血单核细胞中hpk1基因的敲除效率：提取人外周血单核细胞中的总蛋白，对其进行sds-page，转移至膜上，并以抗hpk1抗体作为一抗进行westernblot。进一步地，本发明提供了一种增加外周血单核细胞中th1细胞因子分泌水平的方法，其包括：(1)制备靶向hpk1的grna；(2)制备cas9蛋白；(3)体外培养和扩增人外周血单个核细胞；(4)将步骤(1)的grna和步骤(2)的cas9蛋白共转染至步骤(3)的人外周血单核细胞中。在本发明的增加外周血单核细胞中th1细胞因子分泌水平的方法中，优选地，所述人外周血单核细胞是t细胞、nk细胞、nkt细胞，更优选地，所述人外周血单核细胞是cd3 t细胞。在本发明的增加外周血单核细胞中th1细胞因子分泌水平的方法中，优选地，所述人外周血单核细胞进一步表达外源嵌合抗原受体。在本发明的增加外周血单核细胞中th1细胞因子分泌水平的方法中，该方法进一步包括步骤(5)：在步骤(4)中获得的grna和cas9蛋白转染的cd3 人外周血单核细胞中表达人源car，优选地，所述人源嵌合抗原受体是car19。在本发明的增加外周血单核细胞中th1细胞因子分泌水平的方法中，其中步骤(4)进一步包括鉴定人外周血单核细胞中hpk1基因的敲除效率。在本发明的增加外周血单核细胞中th1细胞因子分泌水平的方法中，优选地，通过pcr-酶消化和/或westernblot方法鉴定人外周血单核细胞中hpk1基因的敲除效率。在本发明的增加外周血单核细胞中th1细胞因子分泌水平的方法中，其中人外周血单核细胞中hpk1基因的敲除效率通过以下步骤鉴定：使用seqidno：7和seqidno：8中所示的引物进行pcr扩增，对pcr产物进行热变性、退火和复性，然后进行t7核酸内切酶处理，并通过琼脂糖凝胶电泳鉴定切割效率。在本发明的增加外周血单核细胞中th1细胞因子分泌水平的方法中，其中人外周血单核细胞中hpk1基因的敲除效率通过以下步骤鉴定：提取人外周血单核细胞中的总蛋白，对其进行sds-page，转移至膜上，并以抗hpk1抗体作为一抗进行westernblot。在第二实施方式中，本发明还提供了用于基因修饰hpk1基因的试剂，通过该试剂对hpk1基因进行基因修饰，从而使hpk1蛋白的功能失活或其活性降低。在一些实施方式中，基因修饰包括基因敲除、部分基因缺失、基因替换和插入。在一些实施方式中，基因修饰包括基因修饰hpk1基因的第二外显子。在一些实施方式中，基因修饰包括使用基因编辑技术修饰hpk1基因；优选地，基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的dna同源重组技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；更优选地，使用基于crispr/cas9的基因编辑技术进行基因修饰。在一些实施方式中，所述试剂是靶向hpk1基因以敲除hpk1基因的grna；优选地，grna靶向hpk1基因的第二外显子。在一些实施方式中，grna能够与seqidno：1所示的序列配对(例如，互补)。在一些实施方式中，制备grna的方法包括：(1)构建grna负载质粒；(2)体外转录grna。在一些实施方式中，步骤(1)包括合成grna编码链和互补链，将编码链和互补链退火形成的双链dna插入puc57载体中，并将其置于t7启动子的控制下以构建puc57kan-t7-grna。在一些实施方式中，步骤(2)包括纯化通过酶消化和测序鉴定的grna负载质粒puc57kan-t7-grna，并使用t7rna体外转录试剂盒在体外转录hpk1grna/hpk1grna，并纯化转录产物以获得grna。在一些实施方式中，grna的双链dna模板序列如seqidno：3和seqidno：4所示。在一些实施方式中，所述试剂进一步包括cas9蛋白；优选地，cas9是重组表达的。在一些实施方式中，通过以下方法产生cas9蛋白：(1)根据人cas9蛋白的氨基酸序列，进行密码子优化后制备全长人cas9cdna；(2)向步骤(1)的全长人cas9cdna的5'和3'端添加核定位信号，以构建重组表达质粒；(3)将重组表达质粒导入宿主细胞以表达重组cas9蛋白；(4)纯化并浓缩重组表达的cas9蛋白；和(5)切下纯化标签并回收约160kd的cas9蛋白。在一些实施方式中，所述试剂进一步包括嵌合抗原受体。在第三实施方式中，本发明还提供了上述试剂中的任何一种在基因修饰中的用途。在一些实施方式中，所述用途是用于敲除单核细胞中的hpk1基因，或增加单核细胞的杀伤活性，或增加单核细胞中的th1细胞因子水平。在第四实施方式中，本发明提供了通过本文任何一种方法制备的单核细胞。在一些实施方式中，所述单核细胞是人外周血单核细胞，优选地，所述人外周血单核细胞是t细胞、nk细胞或nkt细胞，更优选是cd3 t细胞，进一步优选是表达外源人嵌合抗原受体的cd3 t细胞，最优选与对cd19、bcma、整联蛋白αvβ6、muc1、egfrviii、her2、egfr、gd2、间皮素等具有特异性的单链抗体嵌合的cd3 t细胞。与未经修饰的外周血单核细胞相比，本发明的具有缺失hpk1基因的外周血单核细胞具有更强的杀伤能力，以及更高的th1细胞因子分泌水平。优选地，它还对肿瘤具有特异性。在第五实施方式中，本发明还提供了上述试剂中的任何一种或上述单核细胞中的任何一种在制备用于修饰单核细胞中的hpk1基因或增加单核细胞的杀伤活性或增加单核细胞中的th1细胞因子水平的药物组合物中的用途。在一些实施方式中，药物组合物用于治疗肿瘤。优选地，所述肿瘤是淋巴瘤或实体瘤。在第六实施方式中，本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述试剂中的任一种或上述单核细胞中的任一种。本发明的技术方案至少具有以下优点：(1)操作简便，敲除效率高。在本发明中，通过多次实验获得位于t细胞基因组hpk1的第二外显子上的靶序列，设计了能够有效靶向hpk1的grna。与其他敲除方法相比，本发明的方法易于操作并适合于体外培养的t细胞的修饰。与其他靶序列相比，本发明的靶序列特别适用于crispr/cas9基因编辑技术，并可以通过crispr/cas9技术有效敲除t细胞的hpk1。(2)t细胞激活程度高，肿瘤杀伤效果好。本发明的修饰的t细胞不仅增殖更快，而且每个细胞具有更强的肿瘤杀伤活性。肿瘤杀伤活性的实验结果表明，本发明的修饰的t细胞的肿瘤杀伤活性高于或甚至显著高于pd1修饰的t细胞。(3)它可以与其他t细胞修饰技术结合使用，达到协同肿瘤杀伤活性。在本发明中，将hpk1基因的crispr/cas9敲除的t细胞修饰技术与car-t技术相结合具有协同作用。通过体外杀伤实验分析，本发明不仅优于单一car-t的技术效果，而且优于结合pd-1敲除的car-t的技术效果。以及(4)它可以抑制t细胞衰竭。在本发明中，通过crispr/cas9敲除t细胞的hpk1基因，流式细胞术分析表明，敲低hpk1可能导致pd1和tim3表达水平下调。因此，可以看出hpk1敲除可以通过抑制t细胞衰竭而增加t细胞杀伤靶细胞和分泌细胞因子的能力。可选的示例性实施方式1-34。以下示出了本发明的一些其他示例性实施例：1、一种基因修饰hpk1基因的方法，其特征在于，所述方法包括基因修饰hpk1基因，从而使hpk1蛋白的功能失活或活性降低。2、根据实施方式1所述的方法，其特征在于所述基因修饰包括基因敲除、部分基因缺失、基因替换和插入。3、根据实施方式1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述基因修饰包括对hpk1基因的第二外显子进行基因修饰。4、根据实施方式1-3中任一项所述的方法，其特征在于所述基因修饰包括使用基因编辑技术修饰hpk1基因。5、根据实施方式4所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的dna同源重组技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物技术；优选地，使用基于crispr/cas9的基因编辑技术进行基因修饰。6、根据实施方式5所述的方法，其特征在于所述方法包括用靶向hpk1基因的grna敲除hpk1基因。7、根据实施方式6所述方法，其特征在于所述grna靶向hpk1基因的第二外显子。8、根据实施方式6-7中任一项所述的方法，其特征在于grna和cas9蛋白一起敲除hpk1基因。9、根据实施方式6-8中任一项所述的方法，其特征在于制备grna的方法包括：(1)构建grna负载质粒；(2)体外转录grna；其中步骤(1)包括合成grna编码链和互补链，将编码链和互补链退火形成的双链dna插入puc57载体中，并将其置于t7启动子的控制下以构建puc57kan-t7-grna；步骤(2)包括纯化通过酶消化和测序鉴定的grna负载质粒puc57kan-t7-grna，并使用t7rna体外转录试剂盒体外转录hpk1grna/hpk1grna，并纯化转录产物以获得grna。10、根据实施方式9所述的方法，其特征在于所述grna的双链dna模板序列如seqidno：3和seqidno：4所示。11、根据实施方式1-10中任一项所述的方法，其特征在于所述基因修饰包括对单核细胞的hpk1基因进行基因修饰；优选地，所述单核细胞是人外周血单核细胞；更优选地，所述人外周血单核细胞是t细胞、nk细胞或nkt细胞；更优选地，所述人外周血单核细胞是cd3 t细胞；最优选地，所述人外周血单核细胞进一步表达外源嵌合抗原受体。12、根据实施方式11所述的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)制备靶向hpk1基因的grna；(2)制备cas9蛋白；(3)体外培养和扩增单核细胞；(4)将步骤(1)的grna和步骤(2)的cas9蛋白共转染至步骤(3)的单核细胞中。13、根据实施方式12所述的方法，其特征在于所述方法进一步包括在步骤(4)共转染后，鉴定单核细胞中hpk1基因的敲除效率，优选地，通过pcr-酶消化和/或蛋白印迹法鉴定人外周血单核细胞中hpk1基因的敲除效率。14、根据实施方式13所述的方法，其特征在于通过以下步骤鉴定单核细胞中hpk1基因的敲除效率：使用seqidno：7和seqidno：8中所示的引物进行pcr扩增，对pcr产物进行热变性、退火和复性，然后进行t7核酸内切酶处理，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定切割效率；可选地，通过以下步骤确定单核细胞中hpk1基因的敲除效率：提取单核细胞中的总蛋白，对其进行sds-page，转移至膜上，并以抗hpk1抗体作为一抗进行westernblot。15、根据实施方式12-14中任一项所述的方法，其特征在于该方法进一步包括步骤(5)：在步骤(4)中获得的grna和cas9蛋白共转染的单核细胞中表达人源嵌合抗原受体(car)。16、根据实施方式15所述的方法，其特征在于所述人源嵌合抗原受体是car19。17、一种用于基因修饰hpk1基因的试剂，其特征在于hpk1基因经该试剂基因修饰，从而使hpk1蛋白的功能失活或活性降低。18、根据实施方式17所述的试剂，其特征在于所述基因修饰包括基因敲除、部分基因缺失、基因替换和插入。19、根据实施方式17-18中任一项所述的试剂，其特征在于所述基因修饰包括对hpk1基因的第二外显子进行基因修饰。20、根据实施方式17-19中任一项所述的试剂，其特征在于所述基因修饰包括使用基因编辑技术修饰hpk1基因；优选地，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的dna同源重组技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；更优选地，使用基于crispr/cas9的基因编辑技术进行基因修饰。21、根据实施方式20所述的试剂，其特征在于所述试剂是靶向hpk1基因以敲除hpk1基因的grna；优选地，grna靶向hpk1基因的第二外显子。22、根据实施方式21所述的试剂，其特征在于所述grna能够与seqidno：1所示的序列配对。23、根据实施方式21-22中任一项所述的试剂，其特征在于制备grna的方法包括：(1)构建grna负载质粒；(2)体外转录grna；其中步骤(1)包括合成grna编码链和互补链，将编码链和互补链退火形成的双链dna插入puc57载体中，并将其置于t7启动子的控制下以构建puc57kan-t7-grna；步骤(2)包括纯化通过酶消化和测序鉴定的grna负载质粒puc57kan-t7-grna，并使用t7rna体外转录试剂盒体外转录hpk1grna/hpk1grna，并纯化转录产物以获得grna。24、根据实施方式23中任一项所述的试剂，其特征在于所述grna的双链dna模板序列如seqidno：3和seqidno：4所示。25、根据实施方式21-24中任一项所述的试剂，其特征在于所述试剂进一步包括cas9蛋白；优选地，所述cas9是重组表达的。26、根据实施方式25所述的试剂，其特征在于所述cas9蛋白是通过以下方面制备的：(1)根据人cas9蛋白的氨基酸序列，进行密码子优化后制备全长人cas9cdna；(2)向步骤(1)的全长人cas9cdna的5'和3'端添加核定位信号，以构建重组表达质粒；(3)将重组表达质粒导入宿主细胞以表达重组cas9蛋白；(4)纯化并浓缩重组表达的cas9蛋白；和(5)切除纯化标签并回收约160kd的cas9蛋白。27、根据实施方式21-26中任一项所述的试剂，其特征在于所述试剂进一步包括嵌合抗原受体。28、如实施方式17-27中任一项所述试剂在基因修饰中的用途。29、根据实施方式28所述的用途，其特征在于所述用途是用于敲除单核细胞中的hpk1基因，或增加单核细胞的杀伤活性，或增加单核细胞中的th1细胞因子水平。30、一种单核细胞，其特征在于所述单核细胞通过实施例1-16中任一项所述的方法制备。31、根据实施方式30所述的单核细胞，其特征在于所述单核细胞是人外周血单核细胞，优选地，所述人外周血单核细胞是t细胞、nk细胞或nkt细胞，更优选地，所述人外周血单核细胞是cd3 t细胞，进一步优选地，所述人外周血单核细胞是表达外源人嵌合抗原受体的cd3 t细胞，最优选地，所述人外周血单核细胞是与对cd19、bcma、整联蛋白αvβ6、muc1、egfrviii、her2、egfr、gd2、间皮素等具有特异性的单链抗体嵌合的cd3 t细胞。32、如实施方式17-27中任一项所述的试剂或如实施例30-31中任一项所述的单核细胞在制备药物组合物中的用途，其特征在于所述药物组合物用于修饰单核细胞中的hpk1基因，或增加单核细胞的杀伤活性，或增加单核细胞中的th1细胞因子水平。33、根据实施方式32所述的用途，其特征在于所述药物组合物用于治疗肿瘤，优选地，所述肿瘤是淋巴瘤或实体瘤。34、一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物包括实施方式17-27中任一项所述的试剂或实施方式30-31中任一项所述的单核细胞。实施例下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施方式。虽然附图中显示了本发明的示例性实施方式，但是应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被本文阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。实施例一般方法和材料用于本文实施例的试剂通常可商购获得，或者可以通过本领域的标准技术制备。例如，用于实施例的各种抗体如下可商购获得：细胞系：在rpmi1640中培养细胞系raji、daudi、k562、u266、rpmi8226和jurkat细胞，并且在5％co2培养箱中，在补充有10％fbs和1％青霉素/链霉素的dmem中，在37℃下培养293t。在5％co2培养箱中，在x-vivo15中，在37℃下进行培养人pbmc。慢病毒载体的产生和转导：通过瞬时转染lenti-293t细胞系产生编码cd19car、her2car和bcmacar的慢病毒上清液。简单地说，通过lipofectamine2000(生命科技公司)用编码car和慢病毒包膜蛋白的质粒转染lenti-293t细胞。转染后48和72小时收集上清液。t细胞的分离和修饰：如前所述，人t细胞被激活和转导。简单地说，从健康供体外周血或白细胞包(西京医院)中分离外周血单核细胞(pbmc)。所有实验均按照所有相关的道德规范并按照irb095091进行。转导前，pbmc用5μg/mlcd3抗体、3μg/mlcd28抗体和100iu/mlil-2激活2d。从脾脏机械分离小鼠t细胞，并使用il-2和5μg/mlcd3抗体、3μg/mlcd28抗体激活所述小鼠t细胞。通过连续3天在retronectin包被的板上离心激活的pbmc和逆转录病毒上清液实现转导(takarabio)。mrna体外转录和cas9蛋白纯化：使用t7mscript系统试剂盒(ambion)产生体外转录rna。cas9蛋白纯化：按照已知程序将cas9基因克隆到pgex4t-1质粒(invitrogen)中。使用一步克隆试剂盒(诺唯赞生物)构建pgex4t-1-cas9质粒。蛋白在大肠杆菌bl21rosetta2(de3)中表达。培养物(2l)在含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的tb培养基中于37℃下生长，直至a600达到0.6。培养物补充有0.2mm异丙基-1-硫代-β-d-吡喃半乳糖苷，并在恒定振荡下于16℃下继续孵育16小时。通过离心收集细胞，并将沉淀物储存在-80℃下。所有后续步骤均在4℃下进行。解冻后的细菌重悬于30ml缓冲液a(20mmtris-hclph7.5，300mmnacl，200mmli2so4，10mm咪唑)中，该缓冲液a中补充有完全不含edta的蛋白酶抑制剂片(罗氏公司)。加入曲拉通x-100至终浓度为0.1％。30min后，将裂解物超声处理以降低粘度。通过贝克曼ja-3050转子以17,000rpm离心1小时除去不溶物。将可溶性提取物分批结合，与5ml已用缓冲液a预平衡的ni2 -次氮基三乙酸-琼脂糖树脂(德国凯杰)混合1小时。离心回收树脂，然后用缓冲液a彻底洗涤。结合的蛋白用含有浓度不断增加的咪唑的imac缓冲液(50mmtris-hclph7.5，250mmnacl，10％甘油)的等分试样逐步洗脱。将含有his6-mbp标记的cas9多肽的200mm咪唑洗脱液合并在一起。在对20mmtris-hclph7.5，150mmnacl，10％甘油透析过夜的过程中，通过用tev蛋白酶裂解以去除his6-mbp亲和标签。通过使用5mlsp琼脂糖凝胶hitrap柱(ge生命科学)从融合标签中分离出不带标签的cas9蛋白。通过尺寸排阻色谱法，使用superdex20010/300gl在20mmtrishclph7.5，150mmkcl，1mmtcep和5％甘油中进一步纯化蛋白。将尺寸排阻的洗脱峰分装、冷冻并在-80℃下保存。基因靶向：启动t细胞激活后48h，使用btxem830(哈佛仪器btx)通过电转移cas9蛋白和grna以转染t细胞。将1×106个细胞与3μgcas9和2μggrna混合到0.2cm比色皿中。电穿孔后，将细胞稀释到培养基中并在37℃，5％co2下孵育细胞。电穿孔后2至4h，将car-慢病毒以指定的感染复数(1×105至1×106范围)添加到培养物中。随后，使用标准条件(37℃并在t细胞生长培养基中扩增，根据需要补充以维持每2至3天约1×106个细胞/ml的密度)培养编辑后的细胞。体内小鼠研究：nod-scidg/(nsg)小鼠可从中国查尔斯河实验室获得。所有小鼠均按照清华大学实验动物研究中心和动物护理和使用委员会的指导饲养。所有动物均保持在无病原体的条件下，并按照国际实验室动物评估和鉴定协会的政策和认证进行护理。体内生物发光成像：采集前5分钟，腹腔注射悬浮于pbs(15mg/ml)中的d-荧光素(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆珀金埃尔默公司)(150mg/kg)。在精诺真ivis光谱成像系统(美国加利福尼亚州阿拉米达精诺真)上收集生物发光图像。使用活体成像软件3.0版(精诺真)获取和定量生物发光成像数据集。流式细胞术：用剪刀将从小鼠分离的肿瘤切碎，然后用肿瘤解离试剂盒消化，并使用gentlemacs(德国美天旎)研磨以产生单细胞悬液。通过70μm过滤器将脾脏研磨以从脾脏中分离出细胞。洗涤细胞，然后在黑暗中用抗体染色15min，然后通过流式细胞术检测。对于细胞内染色，使用固定和通透试剂盒(bd生物科学)将细胞进一步通透并用抗体染色。使用lsrfortessa或facsariaii(bd生物科学)分析所有样品，并使用flowjo软件分析数据。使用thetmnwshpqfek标签抗体、fitc和人cd3抗体检测cd19car。用生物素化蛋白l(皮尔斯蛋白生物学)和人cd3抗体检测her2和bcmacar。所有显示cart细胞表型数据的facs图均在门控car 细胞上进行。对于模拟转导的t细胞，将整个t细胞群用于分析。人car-t细胞的细胞毒性测定：在a12-h非放射性细胞毒性分析中检测car-t细胞杀伤靶标的能力。将转导的t细胞和utdt细胞解冻，并在37℃下在t细胞培养基中的6孔板中静置24h。将效应子和靶标以指定的效应子：靶标(e：t)比率混合在一起，并在带有3×104个靶细胞的黑壁96孔平底平板中培养，在t细胞培养基中每孔的总体积为200μl。12h后，将所有检测孔和对照孔中的50μl等分试样转移到新鲜的96孔平底透明板上，然后将50μl试剂(美国普洛麦格)加入每个样品等分试样中。用箔纸或不透明的盒子盖住板，以避光，并在室温下孵育30分钟。向96孔板的每个孔中添加50μl终止溶液，最后，使用注射器针头弹出任何大气泡，并在添加终止溶液后1小时内记录490nm或492nm处的吸光度。使用以下公式中的校正值计算细胞毒性百分比：细胞毒性百分比＝100×实验性ldh释放(od490)/最大ldh释放(od490)。elisa测定：洗涤靶细胞并将其以1×106个细胞/ml的浓度悬浮在x-vivo15培养基中。值得注意的是，将每种靶细胞类型100ml平行三份添加到96孔圆形底板(康宁公司)中。洗涤效应t细胞并将其以1×106个细胞/ml重悬于x-vivo15培养基中，然后在指定的孔中将100mlt细胞与靶细胞合并。将板在37℃下孵育6至12小时。孵育后，收集上清液并进行elisa测定(ebioscience)。所有小鼠均被安乐处死；收集全血，并在室温下凝结1h。以5,000rpm离心收集血清，并冷冻保存(-80℃)。根据luminex分析试剂盒产品说明(r&dsystems)对白介素2(il-2)、ifn-γ、tnf-α、il-6和il-10进行luminex分析。westernblot：通过在150μlripa缓冲液(pbs，1％np40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠[sds])中用1×蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物(cst)和0.5mm钒酸钠(新英格兰生物实验室)裂解5×106个经洗涤的细胞以产生cart细胞的全细胞裂解液，然后在冰上孵育30min。将样品在4℃下超声处理5min以剪切dna。然后使用抗hpk1抗体或抗pd-1抗体一抗对离心样品的上清液进行westernblot。实施例1.grna的设计与合成1.向导rna的设计负载grna的质粒为puc57kan-t7-grna，设计靶向hpk1的grna，并将靶向pd1的grna用作对照。与基因组配对的特异性靶向hpk1的grna的序列是gacctggtggcactgaaga(位于hpk1的第二外显子，seqidno：1)；与基因组配对的特异性靶向pd1的grna的序列为ggccaggatggttcttaggt(位于pd1的第一外显子，seqidno：2)。hpk1grna：f:5′-tagggacctggtggcactgaaga-3′(seqidno：3)r:5′-aaactcttcagtgccaccaggtc-3′(seqidno：4)pd1grna：f:5′-taggggccaggatggttcttaggt-3′(seqidno：5)r:5′-aaacacctaagaaccatcctggcc-3′(seqidno：6)。合成grna编码链和互补链，通过对hpk1grna和pd1grna的两条dna链进行退火形成双链dna模板，将其在t7启动子的控制下插入到puc57质粒载体中，以构建包含t7启动子、grna靶向序列和嵌合grna支架的puc57kan-t7-hpk1grna和puc57kan-t7-pd1grna。2.向导rna体外转录为信使rna用drai消化经测序验证的正确质粒puc57kan-t7-hpk1grna和puc57kan-t7-pd1grna，以获得grna转录模板，然后使用纯化试剂盒进行grna转录模板的纯化。使用t7rnakit转录试剂盒(ambion_mmessage_mma-chine_t7)对纯化的产物进行hpk1grna/hpk1grna体外转录，并使用rna纯化试剂盒(megacleartmki，ambion)纯化转录产物。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定纯化的grna，结果如图1所示。使用nanodrop2000超微量分光光度计检测grna的浓度和纯度，将grna分装并储存在-80℃下使用。设计，合成和纯化其他grna。这些grna具有靶向hpk-1基因中的以下靶序列的序列：靶结构域序列人hpk-1基因上的定位seqidno：11__gctcgagacaaggtgtcag第二外显子seqidno：12__aaggtgtcaggggacctgg第二外显子seqidno：13__accactatgacctgctacag第一外显子seqidno：14_gacctgctacagcggctggg第一外显子seqidno：15gctgggtggcggcacgtatg第一外显子在一些实施例中，这些grna可用于替代如上所述靶向seqidno：1的grna。图25显示了使用每种grna的代表性hpk-1基因编辑效率，通过实施例4中的方法进行检测。在图25中，nc为对照，3#显示靶向seqidno：15的grna的结果；4#显示了靶向seqidno：11的grna的结果；5#显示了靶向seqidno：12的grna的结果；6#显示了靶向seqidno：1的grna的结果；1#显示了靶向seqidno：13的grna的结果；2#显示靶向seqidno：14的grna的结果。实施例2.cas9蛋白的重组表达和纯化根据文献报道的方法制备了人源化的cas9(序列在seqidnos：18和19中提供)。chang,n等人,细胞研究23:465-472(2013)，其内容通过引用以其整体并入本文，包括人源化、密码子优化的cas9cdna的序列和其中报道的蛋白序列。简单地说，用于负载cas9的质粒是pgex4t-1，并通过pcr获得密码子优化的全长人cas9cdna。模板是质粒puc19-t7-cas9。核定位信号(nls)被添加到cas9序列的5'和3'端，以促进cas9蛋白的细胞核输入。成功构建质粒后，通过大肠杆菌表达cas9蛋白，通过gst柱纯化，浓缩并收集蛋白，通过凝血酶剪切gst标签，在160kd带附近观察到一条蛋白带(图2)。实施例3.人外周血单核细胞的体外扩增和转染使用甲泛影钠溶液通过离心和快速分离方法提取人外周血单核细胞。使用cd3磁珠对cd3阳性外周血单核细胞进行分选，使用cd3/28抗体激活t细胞，并在含有100u/mlil-2的lonza-x-vivo15培养基中在37℃/5％co2的条件下培养2天后进行病毒转染和电穿孔。将cas9蛋白和grnamrna按一定比例混合，并在室温下静置10分钟，同时，将4.0×106个cd3 t细胞(用cd3/cd28抗体体外激活48小时)转移至15ml离心管中。将细胞以500xg离心5分钟，然后重悬于400μl优化培养基(包含cas9和grna的混合物)。将细胞混合物转移至间隙为4mm的btx比色杯中，置于冰上10分钟，并将该比色杯置于btxgeminix2电穿孔仪中进行电转化。电转化条件为500v和1ms。电穿孔结束后，立即将细胞悬浮液添加到含有il-2(100iu/ml)的培养基(lonza-x-vivo15)中，预热至37℃。电转化后4小时，将载有人源cd19car的病毒的moi值设为10，并将聚凝胺加入到培养基中，最终浓度为10mg/ml。加入病毒后24小时，更换培养基，然后每隔一天进行细胞传代。实施例4.通过酶消化鉴定基因敲除效率(t7e1测定)细胞电转化3天后，收获细胞并提取细胞基因组。通过pcr扩增具有突变位点(crispr/cas9的靶位点)的dna片段。设计两对引物1#和2#，其中1#引物用于pcr扩增用hpk1grna转化的细胞基因组，而2#引物用于pcr扩增用pd1grna转化的细胞基因组。两对引物序列如下：1#:f:5′-agcgagagtgaggaggggg-3′(seqidno：7)r:5′-ttcatcaccagagataactccc-3′(seqidno：8)2#:f:5′-ccaccctctccccagtcctaccccctcctcacccctcct-3′(seqidno：9)r:5′-ggtccctccagacccctcgctccgggacccctgggctgc-3′(seqidno：10)使用pcr仪对扩增得到的pcr产物进行热变性、退火和复性处理，设置步骤如下：95℃3min，85℃1.5min(降温速度0.1℃/s)，75℃1.5min(0.1℃/s)，65℃1.5min(0.1℃/s)...25℃1.5min(0.1℃/s)，4℃。向经处理的pcr产物混合物中加入t7核酸内切酶1(neb)，在37℃下放置15分钟，然后进行琼脂糖凝胶电泳(2％琼脂糖凝胶)以测定消化效率。结果如图3所示。实施例5.通过westernblot法鉴定基因敲除效率电转化细胞后3天，收集细胞，提取细胞蛋白，并通过westernblot检测hpk1和β-肌动蛋白的表达。结果如图4所示。下表显示了具体分组：实施例3详细描述了人外周血单核细胞的体外扩增、电转化和病毒转染步骤。图4显示了与t细胞、car19 t细胞和car19 pd /-t细胞相比，car19 hpk1 /-t细胞中hpk1的表达水平显著降低。图26显示了通过westernblot测量的敲除效率的代表性量化。实施例6.通过流式细胞术检测car19的转染效率和pd1的表达用病毒转染细胞后7天，从每组中取出1×106个细胞，并在4℃避光下与抗体孵育后检测car和hpk1的表达。结果如图5所示。具体分组显示在下表中：实施例3详细描述了人外周血单核细胞的体外扩增、电转化和病毒转染步骤。图5显示，与简单car19t细胞相比，car19 hpk1 /-t细胞和car19 pd1 /-t细胞表面上pd1受体的表达显著降低。car19 hpk1 /-t细胞和car19 pd1 /-t细胞表面的pd1受体表达水平接近，无显著差异。实施例7.t细胞杀伤实验效应细胞是通过上述电转化和病毒转染转染的cd3 人t细胞，靶细胞分别是raji、daudi、k562人恶性淋巴瘤细胞系。将100μl靶细胞铺于96孔板中，24小时后，加入100μl效应细胞(1×106个/ml)，每份样品做3个重复孔。通过在37℃，体积分数为5％的co2培养箱中孵育细胞12h来收集上清。使用promegacytotox非放射性细胞杀伤检测试剂盒测定细胞上清中乳酸脱氢酶(ldh)的含量。在微型振荡器上振荡5min后，用酶标仪在490nm波长处检测到，细胞杀伤功能按如下公式计算：下表显示了具体的分组：实施例3详细描述了人外周血单核细胞的体外扩增、电转化和病毒转染步骤。t细胞对三种人恶性淋巴瘤细胞系的杀伤作用如图6所示。在图6中，car19 hpk1 /-t细胞几乎在各种效靶比的情况下对三种人恶性淋巴瘤细胞系的杀伤效果均最佳(除了对k562细胞系在效靶比5:1的条件下)。对于raji和daudi细胞系，在效靶比为1：1和5：1的条件下，car19 hpk1 /-t细胞的杀伤作用与其他各组差异显著；在效靶比10:1的条件下，car19 hpk1 /-t细胞的杀伤作用与其他各组差异极显著。实施例8.通过t细胞检测分泌的细胞因子将car19 cd3 人t细胞和三种靶细胞(raji、daudi、k562)以2:1的比例共培养12小时，然后收集上清液，分别用ebioscience的elisa检测试剂盒检测上清液中ifn-γ和il-2的含量。结果如图7所示。图7中，car19 hpk1 /-t细胞对raji和daudi的杀伤效果高于其他组。car19 hpk1 /-t细胞和car19 pd1 /-t细胞对raji的杀伤效果与其它组相比差异极显著。car19 hpk1 /-t细胞对daudi的杀伤效果与其它组相比差异极显著，car19 pd1 /-t细胞对daudi的杀伤效果与其它组相比差异显著。实施例9.t细胞对人淋巴瘤的小鼠模型的作用试验动物：雌性nodscid小鼠。所有小鼠均按照清华大学实验动物研究中心和动物护理和使用委员会的指导饲养。所有动物均保持在无病原体的条件下，并按照国际实验室动物评估和鉴定协会的政策和认证进行护理。试验方法：图12显示了体内动物研究的常规时间表。简单地说，在第0天，对6至10周龄的nod-scidg/(nsg)小鼠的右侧腹皮下注射1×106个raji肿瘤细胞。在raji肿瘤接种后第4天，通过尾静脉用1×106个t细胞或cd19car-t细胞处理小鼠，以使两种肿瘤的体积均约为100mm3。每7天测量一次肿瘤。在连续的测量日中没有可见的或可触知的肿瘤的小鼠被认为是“完全消退”。如果动物表现出痛苦体征或当肿瘤总大小达到2500mm3时，将其安乐处死。将40只雌性nodscid小鼠随机分为6组，每组8只。通过皮下注射向每组小鼠接种raji细胞，以构建人淋巴瘤的小鼠模型。ctrol组是空白对照组，使用200μl生理盐水代替给予的细胞。t细胞处理组为阴性对照组，给药细胞为1×106个t细胞。给予car-twt处理组的细胞是1×106个car-t细胞。给予car-thpk1ko处理组的细胞是1×106个hpk1-/-car-t细胞。给予car-tpd1ko处理组的细胞是1×106个pd1-/-car-t细胞。每组小鼠以单剂量给药。(1)测量肿瘤体积在给药前测量小鼠的肿瘤体积，并且在给药后每周两次测量小鼠肿瘤的长径和短径，从而计算并记录肿瘤体积。肿瘤体积可以反映小鼠中肿瘤的增殖。用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径：肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长径(mm)×肿瘤短径2(mm2)×0.5。比较各个剂量组之间的差异以及各剂量组与阴性对照组之间的差异。(2)体内成像检测对小鼠进行体内成像检测。在检测之前将小鼠剃毛，并通过腹腔注射戊巴比妥钠溶液(15μg/g体重)麻醉小鼠。每组小鼠腹腔注射200μl的15g/l荧光素溶液，并在5分钟后，进行体内成像观察。(3)car-t增殖测定给药前采集小鼠外周血，测定小鼠外周血中cd3阳性细胞的百分率，给药后每10天采集小鼠外周血，测定小鼠外周血中cd3阳性细胞。cd3阳性细胞的数量反映了小鼠外周血中car-t细胞的增殖。通过流式细胞术确定小鼠外周血中cd3阳性细胞的百分比。用手术刀切开小鼠的尾静脉以收集血液，并在装有20μl的0.5medta抗凝溶液的1.5mlep管中收集约100μl外周血。充分混合后，添加100μlpbs，并以400g离心5min，弃去上清液，将沉淀物重悬于1ml红细胞裂解液中，并置于4℃的冰箱中15min，充分裂解红细胞。在以400g离心5min后，弃去上清液，用200μlpbs洗涤沉淀两次，重悬于200μlpbs中，充分混合，然后通过流式细胞术检测。比较不同剂量组之间的差异以及各剂量组与阴性对照组之间的差异。(4)浸润性肿瘤组织的car-t细胞表型的测定在肿瘤接种后第28天，通过流式细胞术检测pd1/tim3/lag3/cd107a/膜联蛋白v在浸润在肿瘤组织中的car-t细胞上的表达。试验结果(1)肿瘤体积的测量图8显示了每组小鼠的肿瘤体积。如图8所示，与t细胞处理组相比，car-twt处理组、car-thpk1ko处理组和car-tpd1ko处理组的肿瘤体积均减少，而car-thpk1ko处理组的小鼠肿瘤体积最小。(2)体内成像检测图9显示了每组小鼠的体内成像结果。从图9可以看出，与t细胞处理组相比，car-twt处理组、car-thpk1ko处理组和car-tpd1ko处理组的治疗效果均更好，而car-thpk1ko处理组中小鼠的治疗效果最佳。(3)car-t增殖测定图10显示了每组中的小鼠给药后，小鼠外周血中cd19cart细胞的百分比。如图10所示，在car-twt处理组、car-thpk1ko处理组、car-tpd1ko处理组中，外周血cart细胞的百分比均大于在t细胞处理组中的百分比，表明car-t细胞在小鼠中增殖。然而，如图10所示，在第10天，car-tpd1ko和car-thpk1ko处理组中的car-t细胞的数量显著高于car-twt处理组中的car-t细胞的数量。在处理20、30和40天后，与处理10天后相比，car-twt处理组和car-tpd1ko处理组中小鼠外周血中car-t细胞的数量显著减少。虽然car-thpk1ko处理组中的细胞数被下调，但其显著高于car-twt处理组和car-tpd1ko处理组的细胞数。(4)car-t细胞表型和功能的检测图11显示了在每组小鼠中给药后28天在小鼠肿瘤中car-t细胞的表型。如图11所示，在t细胞凋亡和细胞杀伤实验中，与car-twt处理组相比，car-thpk1ko处理组表现出较少凋亡和增强的杀伤功能，而与car-twt处理组相比，car-tpd1ko处理组无明显差异。与car-twt处理组相比，car-thpk1ko处理组的t细胞衰竭的表面标志物分子pd1/tim3/lag3显著下调，而与car-twt处理组相比，car-tpd1ko处理组中仅pd1显著降低，其他处理组之间无显著差异。实施例10.her2cart细胞中的hpk-1基因敲除her2cart细胞在离体扩增研究中也出现衰竭。参见图13a-13d。该实施例显示了hpk-1基因敲除对her2cart细胞的作用。具有hpk-1基因敲除的her2cart细胞的制备遵循本文所述“一般方法和材料”部分中所述程序。用于该敲除的grna包括靶向hpk-1基因的靶结构域的序列(具有seqidno：1)。按照实施例2中所述程序制备和分离cas9蛋白。使用实施例1中所示的相同grna制备pd-1敲除的her2cart细胞，并将其用作对照。her2cart细胞表达含有4-1bb/cd3ζ信号模块的her2-car。细胞扩增遵循与实施例3中所述相似的步骤。按照实施例5中描述的相同程序通过westernblot评估hpk-1敲除效率，并通过facs评估her2car表达。如图14a-c所示，hpk-1敲除未影响t细胞上her2car的转导和表达。图14b还显示，grna/cas9可以有效敲除her2cart细胞中的hpk1基因。与在cd19cart细胞中观察到的相似，敲除hpk1基因也显著降低t细胞表面pd1的表达，并且与pd-1敲除cart细胞基本相同。实施例11.hpk-1基因敲除的her2cart细胞的体内效率本实施例研究了敲除hpk-1的her2cart细胞的体内行为。在第0天，6至10周龄的nsg小鼠通过腹腔注射接种5×106个skov-3肿瘤细胞。在skov-3肿瘤接种后第10天，通过尾静脉用1×106个t细胞或her2car-t细胞处理小鼠，以使两种肿瘤的体积均约为100mm3。每3-4天测量一次肿瘤。在连续的测量日中没有可见的或可触知的肿瘤的小鼠被认为是“完全消退”。如果动物表现出痛苦体征或当肿瘤总大小达到2500mm3时，将其安乐处死。结果显示在图15-18中。如图15所示，在该肿瘤模型中，hpk1敲除显著增强了her2cart细胞的效率。用hpk1-her2cart细胞处理的小鼠在28天内出现最低肿瘤生长，并且小鼠的生存期显著延长。另一方面，与野生型her2cart细胞相比，pd1-her2cart细胞的改善作用显著性较低。进一步的研究还表明，敲除hpk1可以增强her2cart细胞浸润肿瘤(见图16)和脾脏(见图17)的能力。与观察到的针对cd19cart细胞的体外衰竭标志物研究相似，还发现hpk1敲除改善her2cart细胞的体内衰竭。见图18。实施例12.bcmacart细胞中的hpk-1基因敲除该实施例研究了bcmacart细胞上的hpk-1基因敲除。具有hpk-1基因敲除的bcmacart细胞的制备遵循本文所述“一般方法和材料”部分中所述程序。用于该敲除的grna包括靶向hpk-1基因的靶结构域的序列(具有seqidno：1)。按照实施例2中所述程序制备和分离cas9蛋白。使用实施例1中所示的相同grna制备pd-1敲除的bcmacart细胞，并将其用作对照。细胞扩增遵循与实施例3中所述相似的步骤。按照实施例5中描述的相同程序通过westernblot评估hpk-1敲除效率，并通过facs评估bcmacar表达。如图19a所示，使用慢病毒的bcma转导是成功的。图19b还显示，grna/cas9在敲除bcmacart细胞中的hpk1基因方面有效。与在cd19cart细胞中观察到的相似，敲除hpk1基因也显著降低t细胞表面pd1的表达，并且与pd-1敲除cart细胞基本相同。见图20。实施例13.hpk-1基因敲除bcmacart细胞的体外效率该实施例研究了hpk-1敲除的bcmacart细胞的体外行为。根据实施例7中所述程序进行该细胞毒性研究。简单地说，将t细胞和car-bcmat细胞与u266、rpmi8226、k562和k562-bcma共培养，在培养12h后，测量细胞毒性。结果如图21所示。如图21所示，hpk1敲除显著增强各种细胞系中bcmacart细胞的细胞毒性。还观察到细胞毒性的改善大于pd-1敲除。图22还显示，hpk1编辑的bcmacart细胞在体外表现出增殖增强。实施例14.hpk-1基因敲除bcmacart细胞的体内效率该实施例研究了hpk-1敲除的bcmacart细胞的体内行为。将6周龄的nsg小鼠移植10mm3多发性骨髓瘤肿瘤组织。在肿瘤达到100mm3后的第30天，通过尾静脉用2×106个t细胞或bcmacar-t细胞处理小鼠。每3-4天测量一次肿瘤。在连续的测量日中没有可见的或可触知的肿瘤的小鼠被认为是“完全消退”。如果动物表现出痛苦体征或当肿瘤总大小达到2500mm3时，将其安乐处死。结果如图23所示。如图23所示，hpk1敲除显著增强该肿瘤模型中bcmacart细胞的效率。用hpk1-bcmacart细胞处理的小鼠在33天内出现最低肿瘤生长。图23还显示，在增强bcmacart细胞的抗肿瘤作用方面，hpk1敲除比pd1敲除更有效。与针对her2cart细胞观察到的衰竭标志物研究相似，还发现hpk1敲除改善了体内bcmacart细胞衰竭。见图24。以上仅是本发明的优选实施例，但是本发明的范围不限于此。在本发明披露的技术范围内，本领域技术人员可以容易想到的修改和改变意在被本发明的范围覆盖。因此，本发明的保护范围应该由权利要求的保护范围来确定。序列表<110>北京宇繁生物科技有限公司<120>一种靶向hpk1的grna和一种编辑hpk1基因的方法<130>1<160>19<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna/rna<213>artificialsequence<400>1gacctggtggcactgaaga19<210>2<211>20<212>dna/rna<213>artificialsequence<400>2ggccaggatggttcttaggt20<210>3<211>23<212>dna/rna<213>artificialsequence<400>3tagggacctggtggcactgaaga23<210>4<211>23<212>dna/rna<213>artificialsequence<400>4aaactcttcagtgccaccaggtc23<210>5<211>24<212>dna/rna<213>artificialsequence<400>5taggggccaggatggttcttaggt24<210>6<211>24<212>dna/rna<213>artificialsequence<400>6aaacacctaagaaccatcctggcc24<210>7<211>19<212>dna/rna<213>artificialse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技术特征：

1.一种具有hpk-1基因的基因破坏(例如，基因敲除)和/或诱导或能够诱导基因破坏的试剂的免疫细胞。

2.如权利要求1所述的免疫细胞，其中所述基因破坏包括hpk-1基因的缺失、突变和/或插入，从而导致hpk-1基因失活、活性降低和/或表达降低。

3.如权利要求1或2所述的免疫细胞，其中所述基因破坏包括hpk-1基因的至少一个外显子(例如，第一或第二外显子)的至少一部分缺失。

4.如权利要求1-3中任一项所述的免疫细胞，其中所述基因破坏包括在hpk-1基因(例如，在第一或第二外显子)中产生双链断裂(dsb)，所述双链断裂通过影响hpk-1基因的插入和缺失(插入缺失标记)的非同源末端连接(nhej)修复。

5.如权利要求1-4中任一项所述的免疫细胞，其中所述试剂是一种抑制性核酸分子。

6.权利要求5所述的免疫细胞，其中所述抑制性核酸分子是rna干扰剂或包括rna干扰剂。

7.如权利要求5或6所述的免疫细胞，其中所述抑制性核酸分子是、包括或编码小干扰rna(sirna)、微rna适应性shrna、短发夹rna(shrna)、发夹sirna、前体微rna(pre-mirna)或微rna(mirna)。

8.如权利要求5-7中任一项所述的免疫细胞，其中所述抑制性核酸分子包括与所述hpk-1基因的核酸序列互补的序列。

9.如权利要求5所述的免疫细胞，其中所述抑制性核酸分子是、包括或编码与所述hpk-1基因的核酸序列互补的反义寡核苷酸。

10.如权利要求1-4中任一项所述的免疫细胞，其中所述试剂是或包括一种或多种降低或能够降低hpk-1在所述免疫细胞中表达的分子，或编码所述一种或多种分子的多核苷酸。

11.如权利要求10所述的免疫细胞，其中所述一种或多种分子是或包括或编码反义分子、sirna、shrna、mirna、基因编辑核酸酶、锌指核酸酶蛋白(zfn)、tal效应子核酸酶(talen)或crispr-cas9组合，所述crispr-cas9组合特异性结合、识别或杂交所述hpk-1基因。

12.如权利要求10或11所述的免疫细胞，其中所述试剂包括基因编辑核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)/cas9和/或tal效应子核酸酶(talen)。

13.如权利要求10-12中任一项所述的免疫细胞，其中所述试剂包括(a)具有与所述hpk-1基因的靶结构域(例如，在第一或第二外显子中)互补的靶向结构域的grna，或编码所述grna的多核苷酸；(b)cas9蛋白，或编码所述cas9蛋白的多核苷酸，或者(a)和(b)的组合。

14.如权利要求10-12中任一项所述的免疫细胞，其中所述试剂包括cas9分子和grna的复合物，所述grna具有与所述hpk-1基因的靶结构域(例如，在第一或第二外显子中)互补的靶向结构域。

15.如权利要求13-14中任一项所述的免疫细胞，其中所述grna具有靶向结构域，所述靶向结构域包括与靶序列完全互补的序列相同或差异不超过3个核苷酸的序列，所述靶序列选自seqidno：1和11-15。

16.如权利要求13-15中任一项所述的免疫细胞，其中所述cas9是化脓链球菌cas9，其可选地通过插入核定位序列(例如，在所述cas9分子的c端和n端的一者或二者插入)进行修饰。

17.如权利要求1-16中任一项所述的免疫细胞，其中在所述免疫细胞中基本上没有其他基因被破坏。

18.如权利要求1-17中任一项所述的免疫细胞，其进一步包括在所述免疫细胞中编码pd-1或pdl-1多肽的基因的基因破坏(例如，基因敲除)。

19.如权利要求1-18中任一项所述的免疫细胞，其是来自受试者的原代细胞。

20.如权利要求1-19中任一项所述的免疫细胞，其是人细胞，如白细胞或人外周血单核细胞。

21.如权利要求1-20中任一项所述的免疫细胞，其呈cd3阳性。

22.如权利要求1-21中任一项所述的免疫细胞，其是t细胞(例如，cd4 或cd8 t细胞、car-t细胞、nkt细胞、αβt细胞或γδt细胞)或nk细胞。

23.如权利要求1-22中任一项所述的免疫细胞，其源自患有癌症的受试者的原代细胞，其中所述癌症是淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、b细胞急性淋巴细胞性白血病(b-all)、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、弥漫性大细胞淋巴瘤(dlcl)、多发性骨髓瘤、肾细胞癌(rcc)、神经母细胞瘤、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肉瘤、前列腺癌、肺癌、食道癌、肝细胞癌、胰腺癌、星形细胞瘤、间皮瘤、头颈癌和/或髓母细胞瘤。

24.如权利要求1-23中任一项所述的免疫细胞，其进一步包括在所述免疫细胞的表面表达的重组受体或编码所述重组受体的多核苷酸，其中所述重组受体与抗原特异性结合，并且其中所述免疫细胞能够在所述重组受体与抗原结合后诱导细胞毒性、增殖和/或分泌细胞因子。

25.如权利要求24所述的免疫细胞，其中所述重组受体是重组t细胞受体或嵌合抗原受体。

26.如权利要求24或25所述的免疫细胞，其中所述重组受体特异性结合独立地选自以下的一种或多种抗原：rorl、her2、ll-cam、cd19、cd20、cd22、cea、乙型肝炎表面抗原、叶酸受体抗体、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd276、cd44、egfr、egp-2、egp-4、epha2、erbb2、erbb3、erbb4、fbp、胎儿型乙酰胆碱受体、gd2、gd3、hmw-maa、il-22r-α、il-13r-α2、kdr、κ轻链、lewisy、l1细胞粘附分子(cd171)、mage-a1、间皮素、muc1、muc16、psca、nkg2d配体、ny-eso-1、mart-1、gp100、瘤胎抗原、tag72、vegf-r2、癌胚抗原(cea)、前列腺特异抗原、psma、雌激素受体、孕激素受体、ephrinb2、cd123、cs-1、c-met、gd-2、magea3、ce7、wilms肿瘤1(wt-1)、细胞周期蛋白a1(ccna1)、bcma和白介素12。

27.如权利要求24或25所述的免疫细胞，其中所述重组受体特异性结合cd19、bcma、整联蛋白αvβ6、muc1、egfrviii、her2、egfr、gd2和/或间皮素。

28.一种细胞群，其包括权利要求1-27中任一项所述的免疫细胞，其特征在于以下一项或多项：(1)细胞群中至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞不表达内源性hpk-1多肽；不包含连续的hpk-1基因、hpk-1基因和/或功能性hpk-1基因；(2)细胞群中hpk-1基因敲除效率至少约为50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，例如，通过根据实施例4中所述t7e1测定和/或实施例5中westernblot的方法确定；(3)通过流式细胞术确定，在细胞表面表达pd-1、tim-3和/或lag-3的细胞群中的细胞百分比低于对照细胞群中的细胞百分比；(4)通过流式细胞术确定，在细胞表面表达膜联蛋白v的细胞群中的细胞百分比低于对照细胞群中的细胞百分比；和(5)通过流式细胞术确定，在细胞表面表达cd107a的细胞群中的细胞百分比高于对照细胞群中的细胞百分比。

29.如权利要求28所述的细胞群，其中至少约50％、75％、80％、85％或90％的所述细胞在细胞表面表达权利要求24-27中任一项所述的重组受体。

30.一种药物组合物，其包括权利要求1-27中任一项所述的免疫细胞或权利要求28或29所述的细胞群，和药学上可接受的载体。

31.一种核酸分子，其可选为表达盒，所述表达盒编码一种或多种降低或能够降低细胞中hpk-1基因表达的分子。

32.如权利要求31所述的核酸分子，其中所述一种或多种分子是、包括或编码反义分子、sirna、shrna、mirna、基因编辑核酸酶、锌指核酸酶蛋白(zfn)、tal效应子核酸酶(talen)或crispr-cas9组合，所述crispr-cas9组合特异性结合、识别或杂交所述hpk-1基因。

33.如权利要求31或32所述的核酸分子，其中所述一种或多种分子是或包括或编码grna，其中所述grna包括与所述hpk-1基因的靶结构域(例如，在第一或第二外显子中)互补的靶向结构域。

34.如权利要求33所述的核酸分子，其中所述grna包括靶向结构域，所述靶向结构域与靶序列完全互补的序列相同或差异不超过3个核苷酸，所述靶序列选自seqidno：1和11-15。

35.如权利要求33所述的核酸分子，其是包括seqidno：3和seqidno：4所示序列的双链dna分子。

36.如权利要求31-35中任一项所述的核酸分子，其进一步包括第二核酸，其可选地是第二表达盒，所述第二表达盒编码抗原受体(car)。

37.一种载体，其包括权利要求31-36中任一项所述的核酸分子。

38.如权利要求37所述的载体，其是或包括质粒载体。

39.如权利要求37所述的载体，其是或包括病毒载体，如逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关载体。

40.一种grna，其包括靶向结构域，所述靶向结构域与hpk-1基因的靶结构域(例如，在第一个或第二外显子中)互补、结合、识别或杂交。

41.如权利要求40所述的grna，其中所述靶向结构域与靶序列完全互补的序列相同或差异不超过3个核苷酸，所述靶序列选自seqidno：1和11-15。

42.如权利要求41-42中任一项所述的grna，其是模块化grna。

43.如权利要求41-42中任一项所述的grna，其是单分子/嵌合grna。

44.如权利要求41-43中任一项所述的grna，其是化脓链球菌或金黄色葡萄球菌grna。

45.一种cas9/grna分子复合物，其包括权利要求41-43中任一项所述的grna和cas9分子。

46.如权利要求45所述的cas9/grna分子复合物，其中所述cas9分子是经一个或多个核定位序列工程化的cas9。

47.如权利要求45或46所述的cas9/grna分子复合物，其中所述cas9分子是化脓链球菌或金黄色葡萄球菌cas9分子。

48.如权利要求45-47中任一项所述的cas9/grna分子复合物，其能够切割所述hpk-1基因的靶结构域(例如，在第一或第二外显子中)。

49.如权利要求45-47中任一项所述的cas9/grna分子复合物，其能够在hpk-1基因(例如，在第一或第二外显子)中产生双链断裂(dsb)。

50.一种免疫细胞，其包括权利要求40-44中任一项所述的grna，或编码所述grna的核酸，或权利要求45-49中任一项所述的cas9/grna分子复合物，或编码cas9和grna的一种或多种核酸分子。

51.一种产生基因工程化免疫细胞的方法，其包括将诱导或能够诱导hpk1基因的基因破坏(例如，基因敲除)的试剂引入免疫细胞。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述试剂包括一种或多种降低或能够降低hpk-1表达的分子，或编码所述一种或多种分子的多核苷酸。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述一种或多种分子是、包括或编码反义分子、sirna、shrna、mirna、基因编辑核酸酶、锌指核酸酶蛋白(zfn)、tal效应子核酸酶(talen)或crispr-cas9组合，所述crispr-cas9组合特异性结合、识别或杂交hpk-1基因。

54.如权利要求51-53中任一项所述的方法，其中所述试剂包括(i)权利要求40-44中任一项所述的grna或(ii)编码所述grna的核酸。

55.如权利要求51-54中任一项所述的方法，其中所述试剂包括权利要求45-49中任一项所述的cas9/grna分子复合物，或一种或多种编码所述cas9和grna的核酸分子。

56.如权利要求51-55中任一项所述的方法，其中所述引入包括将所述免疫细胞与所述试剂在体外接触。

57.如权利要求51-56中任一项所述的方法，其中所述引入包括电穿孔。

58.如权利要求51-57中任一项所述的方法，其进一步包括将编码权利要求24-27中任一项所定义的重组受体的核酸分子引入所述免疫细胞。

59.如权利要求51-58中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是来自受试者的原代细胞。

60.如权利要求51-59中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是人细胞，如白细胞或人外周血单核细胞。

61.如权利要求51-60中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞呈cd3阳性。

62.如权利要求51-61中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是t细胞(例如，cd4 或cd8 t细胞、car-t细胞、nkt细胞、αβt细胞或γδt细胞)或nk细胞。

63.如权利要求51-62中任一项所述的方法，其对多个免疫细胞施行。

64.一种通过权利要求51-63中任一项所述的方法产生的免疫细胞或细胞群。

65.一种改变t细胞的方法，其包括将t细胞与试剂接触，所述试剂诱导或能够诱导hpk1基因的基因破坏(例如，基因敲除)。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述试剂包括一种或多种分子，所述一种或多种分子是、包括或编码反义分子、sirna、shrna、mirna、基因编辑核酸酶、锌指核酸酶蛋白(zfn)、tal效应子核酸酶(talen)或crispr-cas9组合，所述crispr-cas9组合特异性结合、识别或杂交hpk-1基因。

67.如权利要求65-66中任一项所述的方法，其中所述试剂包括(i)权利要求40-44中任一项所述的grna或(ii)编码所述grna的核酸。

68.如权利要求65-67中任一项所述的方法，其中所述试剂包括权利要求45-49中任一项所述的cas9/grna分子复合物，或者一种或多种编码所述cas9和grna的核酸分子。

69.如权利要求65-68中任一项所述的方法，其中所述t细胞来自患有癌症的受试者，例如，选自以下的癌症：淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、b细胞急性淋巴细胞性白血病(b-all)、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、弥漫性大细胞淋巴瘤(dlcl)、多发性骨髓瘤、肾细胞癌(rcc)、神经母细胞瘤、直肠结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肉瘤、前列腺癌、肺癌、食道癌、肝细胞癌、胰腺癌、星形细胞瘤、间皮瘤、头颈癌和髓母细胞瘤。

70.如权利要求65-69中任一项所述的方法，其中与所述试剂的接触在体外或离体进行。

71.如权利要求65-70中任一项所述的方法，其进一步包括在将核酸引入t细胞的条件下，将所述t细胞与核酸接触，所述核酸编码权利要求36-39中任一项所定义的重组受体。

72.一种通过权利要求65-71中任一项所述的方法产生的改变的t细胞或细胞群。

73.一种增强免疫细胞群的细胞毒性、抑制衰竭和/或增强在脾脏和/或肿瘤中的浸润的方法，该方法包括将所述免疫细胞群与试剂接触，所述试剂诱导或能够诱导hpk1基因的基因破坏(例如，基因敲除)。

74.如权利要求73所述的方法，其中所述试剂包括一种或多种分子，所述一种或多种分子是、包括或编码反义分子、sirna、shrna、mirna、基因编辑核酸酶、锌指核酸酶蛋白(zfn)、tal效应子核酸酶(talen)或crispr-cas9组合，所述crispr-cas9组合特异性结合、识别或杂交hpk-1基因。

75.如权利要求73-74中任一项所述的方法，其中所述试剂包括(i)权利要求40-44中任一项所述的grna或(ii)编码所述grna的核酸。

76.如权利要求73-75中任一项所述的方法，其中所述试剂包括权利要求45-49中任一项所述的cas9/grna分子复合物，或者一种或多种编码cas9和grna的核酸分子。

77.如权利要求73-76中任一项所述的方法，其中所述接触有效地诱导免疫细胞中hpk-1基因的基因破坏(例如，基因敲除)以提供细胞群，其特征在于以下一项或多项：(1)细胞群中至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞不表达内源性hpk-1多肽；不包含连续的hpk-1基因、hpk-1基因和/或功能性hpk-1基因；(2)细胞群中hpk-1基因敲除效率至少约为50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，例如，通过根据实施例4中所述t7e1测定和/或实施例5中westernblot的方法确定；(3)通过流式细胞术确定，在细胞表面表达pd-1、tim-3和/或lag-3的细胞群中的细胞百分比低于在接触前测得的免疫细胞群中的细胞百分比；(4)通过流式细胞术确定，在细胞表面表达膜联蛋白v的细胞群中的细胞百分比低于在接触之前测得的免疫细胞群中的细胞百分比；和(5)通过流式细胞术确定，在细胞表面表达cd107a的细胞群中的细胞百分比高于在接触之前测得的免疫细胞群中的细胞百分比。

78.如权利要求73-77中任一项所述的方法，其进一步包括选择包含hpk-1基因的基因破坏(例如，基因敲除)的免疫细胞。

79.如权利要求73-78中任一项所述的方法，其进一步包括扩增包含hpk-1基因的基因破坏(例如，基因敲除)的免疫细胞。

80.如权利要求79所述的方法，其中所述扩增在体外、离体或体内进行。

81.如权利要求73-80中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞群是t细胞群(例如，cart细胞群)。

82.一种产生免疫细胞(例如，改变t细胞)的方法，其包括(a)从人类患者获得免疫细胞(例如，t细胞)；(b)在免疫细胞(例如，t细胞)中引入诱导或能够诱导hpk-1基因破坏的试剂；和(c)用所述试剂孵育并可选地扩增免疫细胞(例如，t细胞)以提供hpk-1基因破坏的免疫细胞(例如，t细胞)群。

83.一种增强免疫细胞群的细胞毒性、抑制衰竭和/或增强在脾脏和/或肿瘤中浸润的方法，其包括(a)从人类患者(例如，如本文所述)获得免疫细胞(例如，t细胞)群；(b)在免疫细胞(例如，t细胞)群中引入诱导或能够诱导hpk-1基因破坏的试剂；和(c)用所述试剂孵育并可选地扩增免疫细胞(例如，t细胞)以提供hpk-1基因破坏的免疫细胞(例如，t细胞)群，与引入试剂之前的细胞群相比，所述hpk-1基因破坏的免疫细胞(例如，t细胞)群具有增强的细胞毒性、降低的衰竭和/或在脾脏和/或肿瘤中增强的浸润。

84.如权利要求82或83所述的方法，其进一步包括在将核酸引入免疫细胞的条件下，将所述免疫细胞(例如，t细胞)与核酸接触，所述核酸编码权利要求36-39中任一项所定义的重组受体，将核酸引入免疫细胞可以与所述试剂的引入同时或依次以任何顺序进行。

85.如权利要求82-84中任一项所述的方法，其中所述试剂包括(i)权利要求40-44中任一项所述的grna或(ii)编码所述grna的核酸。

86.如权利要求82-85中任一项所述的方法，其中所述试剂包括权利要求45-49中任一项所述的cas9/grna分子复合物，或编码cas9和grna的一种或多种核酸分子。

87.如权利要求82-86中任一项所述的方法，其中所述人类患者患有癌症，其中所述癌症是淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(cll)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、急性淋巴细胞白血病、急性髓样白血病、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、弥漫性大细胞淋巴瘤(dlcl)、多发性骨髓瘤、肾细胞癌(rcc)、神经母细胞瘤、直肠结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肉瘤、前列腺癌、肺癌、食道癌、肝细胞癌、胰腺癌、星形细胞瘤、间皮瘤、头颈癌和/或髓母细胞瘤。

88.如权利要求82-87中任一项所述的方法，其中hpk-1基因破坏的免疫细胞(例如，t细胞)群的特征在于以下一项或多项：(1)细胞群中至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞不表达内源性hpk-1多肽；不包含连续的hpk-1基因、hpk-1基因和/或功能性hpk-1基因；(2)细胞群中hpk-1基因敲除效率至少约为50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，例如，通过根据实施例4中所述t7e1测定和/或实施例5中的westernblot的方法确定；(3)通过流式细胞术确定，在细胞表面表达pd-1、tim-3和/或lag-3的细胞群中的细胞百分比低于对照细胞群中的细胞百分比；(4)通过流式细胞术确定，在细胞表面表达膜联蛋白v的细胞群中的细胞百分比低于对照细胞群中的细胞百分比；和(5)通过流式细胞术确定，在细胞表面表达cd107a的细胞群中的细胞百分比高于对照细胞群中的细胞百分比。

89.一种car-t细胞群，其特征在于：

a.细胞群中至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞不表达内源性hpk-1多肽；不包含连续的hpk-1基因、hpk-1基因和/或功能性hpk-1基因；或者细胞群中hpk-1基因敲除效率至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，例如，通过根据实施例4中所述t7e1测定和/或实施例5中的westernblot的方法确定；和

b.至少约50％、75％、80％、85％或90％的细胞在细胞表面表达嵌合抗原受体。

90.如权利要求89所述的car-t细胞群，其特征进一步在于：

a.通过流式细胞术确定，在细胞表面表达pd-1、tim-3和/或lag-3的细胞群中的细胞百分比低于对照细胞群中的细胞百分比；

b.通过流式细胞术确定，在细胞表面表达膜联蛋白v的细胞群中的细胞百分比低于对照细胞群中的细胞百分比；和/或

c.通过流式细胞术确定，在细胞表面表达cd107a的细胞群中的细胞百分比高于对照细胞群中的细胞百分比。

91.一种组合物，其包括来自癌症患者的t细胞，和一种用于敲除t细胞中hpk-1基因的工具。

92.如权利要求91所述的组合物，其中所述t细胞是来自癌症患者的原代t细胞、car-t细胞、carnk细胞或nk细胞。

93.一种治疗疾病或病症的方法，其包括将治疗有效量的权利要求1-29中任一项所述的免疫细胞或细胞群、权利要求30所述的药物组合物，权利要求67所述的免疫细胞或细胞群、权利要求77所述的改变的t细胞或细胞群、权利要求89-90所述的car-t细胞群或者权利要求91-92所述的组合物给药至有需要的受试者。

94.一种治疗疾病或病症的方法，其包括(a)从需要治疗的受试者获得免疫细胞(例如，t细胞)；(b)在免疫细胞(例如，t细胞)中引入诱导或能够诱导hpk-1基因破坏的试剂；(c)用所述试剂孵育并可选地扩增免疫细胞以提供hpk-1基因破坏的细胞群；和(d)将hpk-1基因破坏的细胞群给药至所述受试者。

95.如权利要求94所述的方法，其进一步包括在将核酸引入免疫细胞的条件下，将所述免疫细胞(例如，t细胞)与核酸接触，所述核酸编码权利要求36-39中任一项所定义的重组受体，将核酸引入免疫细胞可以与所述试剂的引入同时或依次以任何顺序进行。

96.如权利要求94-95中任一项所述的方法，其中所述试剂包括(i)权利要求40-44中任一项所述的grna或(ii)编码所述grna的核酸。

97.如权利要求94-96中任一项所述的方法，其中所述试剂包括权利要求45-49中任一项所述的cas9/grna分子复合物，或编码所述cas9和grna的一种或多种核酸分子。

98.如权利要求93-97中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是感染性疾病或病症、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。

99.如权利要求93-98中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症或肿瘤，其是白血病、淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、急性淋巴细胞性白血病(all)、非霍奇金淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性b细胞淋巴瘤、b细胞恶性肿瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑素瘤癌、骨癌、脑癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺腺癌、霍奇金淋巴瘤、子宫颈癌、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、尤因肉瘤、髓母细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤和/或间皮瘤。

技术总结
本发明涉及一种靶向HPK1的gRNA和一种编辑HPK1基因的方法。本发明的HPK1gRNA和HPK1基因编辑方法可以敲除T细胞HPK1基因、增强T细胞杀伤活性、增加外周血单核细胞的Th1细胞因子水平，并且敲除T细胞HPK1基因，还可以下调PD‑1和TIM3在T细胞表面的表达并可以抑制T细胞衰竭。因此，本发明可以用于制备用于治疗肿瘤的药物，特别是嵌合抗原受体细胞肿瘤靶向疗法(CAR‑T、CAR‑NK、CAR‑NKT、CAR‑γδT细胞疗法)。

技术研发人员：廖学斌;司静文
受保护的技术使用者：北京宇繁生物科技有限公司
技术研发日：2018.09.20
技术公布日：2020.06.09