相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年8月9日提交的标题为从工程微生物中生物合成圣草酚(biosynthesisoferiodictyolfromengineeredmicrobes)的美国临时专利申请号：62/542,843的优先权，其全部公开内容通过引用合并于此。
本发明的领域涉及从前体分子，特别是从柚皮素中生产圣草酚的有用方法和过程。更特别地，本发明经由体内酶促转化从柚皮素中生产圣草酚。
背景技术：
本发明集中于柚皮素向圣草酚的转化。本公开涉及经由微生物发酵合成圣草酚。
类黄酮是植物界中存在的数量最多且结构多样的天然产物之一。众所周知，它们对人体健康具有各种各样有益的医学和化学预防作用。类黄酮已被证明作为抗氧化剂、抗细菌剂、消炎剂，并具有抗癌性质。然而，由于这些化合物的低水溶性和整体不稳定性，这些化合物的药物应用受到限制。化学上，黄酮是2-苯基-4h-1-苯并吡喃-4-酮，其中在环的各个位置上可能存在或甚至缺失羟基。黄酮的一个实例是芹黄素，其化学名是2-(对羟基苯基)-4h-1-(5，7-二羟基苯并吡喃-4-酮)。因此，此定义包含传统意义上的黄烷、黄烷-3-醇(儿茶酚)、黄烷-3，4-二醇(白花色素苷)、黄酮、黄酮醇和二氢黄酮。本发明中相关的黄酮是：柚皮苷、柚皮素和圣草酚。
类黄酮是使用类苯基丙烷途径合成的次生植物代谢产物(winkel-shirley，2001)，并且存在于多种植物中。由于类黄酮衍生的化合物用作人类饮食中促进健康的组分，因此已备受关注。这是由于它们具有多种癌症化学预防、抗氧化和抗哮喘活性(bravo1998；lamartiniere2000；file等人2001；以及lemarchand2002)。然而，植物中特定类黄酮的确切分布和数量在物种之间存在很大差异。
如上所述，类黄酮是具有多种生物活性的重要天然化合物。来源于柑橘类来源的类黄酮构成了潜在的医学上重要的类黄酮系列。柚皮素属于这一系列的黄酮类，并且已发现在哺乳动物系统中显示出强大的抗炎和抗氧化活性。几项调查研究表明，补充另一种柑橘来源的类黄酮、柚皮苷和柚皮苷补剂对治疗人类的肥胖症、糖尿病、高血压和代谢综合症有益。已经阐明了这些有益活性的几种分子机理。然而，它们对肥胖症和代谢疾病的作用机理尚待完全确定。
柚皮苷
柚皮苷是黄烷酮-7-o-糖苷，可经酶促修饰成为柚皮素。柚皮素天然存在于柑橘类水果中，尤其是葡萄柚中，柚皮苷是造成水果苦味的原因。在商业葡萄柚汁生产中，柚皮苷酶可用于去除柚皮苷产生的苦味。
柚皮苷抑制一些药物代谢的细胞色素p450酶(包含cyp3a4和cyp1a2)，这可能导致全身性药物-药物的相互作用。摄入柚皮苷和相关类黄酮也会影响某些药物的肠道吸收，导致循环中药物水平的升高或降低。为了避免干扰药物的吸收和代谢，在服用可能受柑橘类黄酮影响的药物的患者中，禁止将柑橘类(尤其是葡萄柚)和其它果汁与药物一起食用。
柚皮素
柚皮素是一种黄烷酮，并且可以在葡萄柚、橙子和西红柿皮中发现。这种生物类黄酮很难通过口服法吸收。但是，已显示当摄入时，它对人类细胞色素p450同工型cyp1a2具有抑制作用。这种有益性质还可扩展为苯并(a)芘代谢酶苯并(a)芘羟化酶(ahh)的有效抑制剂。同样地，在体外和动物研究中，柚皮素也已经显示为减少对dna的氧化损伤。柚皮素也已经显示为通过细胞培养中受感染的肝细胞(肝脏细胞)减少丙型肝炎病毒的产生。这似乎是继柚皮素抑制细胞分泌极低密度脂蛋白能力的第二位。柚皮素还可保护ldlr缺陷型小鼠免受高脂饮食的肥胖症作用。柚皮素通过抑制高胆固醇饮食的大鼠的hmg-coa还原酶和acat来降低血浆和肝胆固醇的浓度。
圣草酚
圣草酚也是在某些植物中发现的类黄酮化合物。与柚皮素相比，它具有额外的羟基化作用。它还具有更高的生物活性。圣草酚能够掩盖苦味，并广泛用于医药和食品生产中。
在提取行业中，圣草酚是从yerbasanta(北美圣草)植物中提取的(ley等人2005)。当在测试中使用时，圣草酚被证明显著降低咖啡因的苦味，而不会表现出固有的浓烈风味或味道特征，这在改变食品、饮料和药品的味道方面具有很大的潜力。此外，与许多其它类黄酮相比，圣草酚拥有更高的生物活性和更强的抗癌活性(lee等人2007；chu等人2016)。关于抗癌作用，圣草酚被认为对正常培养的人类细胞几乎没有作用(matsuo等人2005)，但已显示在hl-60白血病细胞中诱导凋亡的dna梯形形成、染色质浓缩和细胞毒性(ogata2000)。
作为次生代谢产物，类黄酮通常在特定的植物物种中以少量或可变的量生产，这妨碍了它们的经济有效分离和广泛应用。此外，这些物种中的某些在其自然栖息地中受到威胁，因此进一步限制了某些植物代谢物用于商业用途的可用性。
就在医药领域的额外用途而言，已发现圣草酚是trpv1拮抗剂，并且可以用作镇痛剂。香草素1受体(trpv1)是钙可渗透通道，负责急性和慢性疼痛信号传导的转导和调节。这样，这种受体是治疗几种疼痛疾病的潜在靶标。
已知在植物中，圣草酚可以通过类黄酮3′-羟化酶(f3′h)(一种细胞色素p450依赖的单加氧酶)的催化作用而通过植物中的柚皮素的羟基化而衍生(brugliera等人，1999；kaltenbach等人1999)。在过去的几十年中，由于从植物和微生物中鉴定和改造了一些细胞色素p450羟化酶，柚皮素的生物催化羟基化作用得以实现(kasai等人，2009；amor等人2010；chu等人2016)。然而，由于p450羟化酶是一种膜结合蛋白，其活性取决于p450还原酶和血红素的生物合成，因此p450在原核系统中的功能性表达具有挑战性(oeda等人，1985)。最近，已经进行了一些努力来鉴定非p450羟化酶，以用于柚皮素生物转化为圣草酚。lin和yan(2014)发现，hpabc最初被鉴定为一种双组分单加氧酶，催化大肠杆菌中4-羟基苯乙酸的邻羟基化，可将柚皮素羟化为圣草酚(lin和yan2014)。lee等人(2014)显示，sam5是一种来自西班牙糖丝菌的单加氧酶，催化咖啡酸羟化为阿魏酸，具有柚皮素的活性。然而，据报道，经由这些非p450羟化酶的圣草酚滴度对于大规模生产用途而言很低。单独表达的sam5酶对大肠杆菌细胞中的类黄酮显示出活性低。p450还原酶的共表达是增加活性的一种方式。然而，通过这种方式刺激类黄酮的羟基化作用是受限的，并且仅观察到约34％至50％的增强(lee等人2014)。
总体而言，本公开的目的是证明经由生物转化生产柚皮素和圣草酚，并提供使这些化合物的体积增加可用于工业以及在药学和药用化妆品领域进行研究的技术。
以此方式，通过生物转化可以更好地解决圣草酚的有限的质量和供应，其中可以修饰天然酶或特定微生物以携带所需的酶，并使用商业上重要的发酵过程来特异性地增加相关类黄酮的产量。
根据本发明，一种实用的方法来改进圣草酚的生产，这将允许其经由生物转化进行经济生产。此外，难以获得足够量的特定类黄酮用作药用食品或用作开发新药的前体，因为其组合物和数量会因天气条件和地理条件而变化很大，即使在已知生产它们的植物中也是如此。为了解决该问题并提供足够量的生物活性类黄酮，一种可行且有希望的方法是通过生物转化进行生物转化(lim等人2004；kim等人2005)。这将逆转从植物界采购这些化合物的有限可用性和高成本。这种相对增加的丰度将允许生产用于食品、制药和化妆品行业的几种类黄酮。
因此，需要将本文提供的类黄酮开发为商业产品，并且需要这样的化合物利用相对普通的起始底物，诸如柚皮素作为起始分子，从而使得此类所需类黄酮的生产在商业上尽可能地具有成本效益。本公开提供了一种从柚皮苷和/或柚皮素生产圣草酚的方法。
更进一步地，从植物中提取的过程通常采用固液提取技术，所述技术使用如己烷、氯仿和乙醇之类的溶剂进行回收。然而，溶剂提取本身是能源密集型的，导致有毒废物处理的问题，需要植物本身的大面积种植，并且产生需要进一步纯化以回收次要成分的产品。因此，还需要新的生产方法以降低圣草酚的生产成本并减轻大规模种植和加工对环境的影响。一种这样的潜在解决方案是使用发酵生物转化技术，所述技术允许某些微生物种类的生产，从而提高了可商购的所需圣草酚的选择性、丰度和纯度。
除上述内容外，虽然消费者批准并积极寻求食品、饲料、调味剂或药用组分的天然和生物来源，但他们也关注货源、口味的一致性概况和环境可持续生产。在这种情况下，本发明的微生物发酵和生产方法以比无机合成或现有植物提取技术更自然的方式提供了对各种工业和研究有用的数量的本发明的类黄酮。
因此，需要开发一种经济且方便地生产圣草酚的新方法，以进一步使人类工业使用和消费成为可能。
技术实现要素：
本发明包含经由修饰的大肠杆菌或其它微生物菌株从柚皮素生产圣草酚的方法。
特别地，本发明提供了经由生物转化来生产圣草酚的方法。
本方法提供了使用特定合成途径在微生物培养基中生物合成圣草酚的方法。
在产品/商业用途方面，在美国市场上有几种含有圣草酚的产品，并且可以用于从镇痛剂到驱虫剂以及用于食品和膳食补充剂的所有产品。含有圣草酚的产品可以是气溶胶、液体或颗粒状制剂。
对于所述实施例中的细胞系统，其选自由细菌、酵母以及其组合组成的组，或将允许用所选择的基因进行遗传转化并随后从柚皮素生物合成生产圣草酚的任何细胞系统。在最优选的微生物系统中，大肠杆菌被用于生产圣草酚和二氢槲皮素((“dhq”)或花旗松素)。
尽管本公开易于进行各种修改和替代形式，但是其特定实施例在附图中以实例的方式示出，并且将在本文中进行详细描述。然而，应理解，本文所呈现的附图和详细描述并非旨在将本公开限制为所公开的特定实施例，而是相反，其意图是涵盖落入本公开的精神和范围内的所有修改、等同形式和替代形式，如所附权利要求所限定的。
参考附图，在下面对本发明的优选实施例的详细描述中，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。
附图说明
图1显示具有关键组分的sam5-prsfduet的质粒图谱。
图2用菌株eri-01对柚皮素进行生物转化为圣草酚的hplc分析。
图3图3用菌株eri-01对柚皮素进行生物转化的lc-ms分析。
图4hpac、ppfr和sefr的序列比对。
图5纯化的黄素还原酶的sds-page。泳道1、3、5是在左侧列出了相应大小的蛋白质标记物。纯化的黄素还原酶由红色箭头指示。泳道2：sefr；泳道4：ppfr以及泳道6：hpac。
图6与hpac活性相比，fad还原酶的相对酶活性。
图7是质粒hpac-pcdf、ppfr-pcdf和sefr-pcdf的图谱。
图8通过hplc测量菌株er01至er05中的圣草酚的生产。
图9菌株er01至er05的每株的er生产。
图10显示含有分离的黄素还原酶hpac、ppfr和sefr中每一种的质粒图谱。
图11用eri-06、eri-07和eri-08的工程菌株生产圣草酚。
图12显示柚皮素的分子结构。c1sh12o5；平均质量：272.253da；柚皮素-iupac名称为5，7-二羟基-2-(4-羟基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮。
图13显示圣草酚的分子结构；c15h12o6；平均质量：288.252da；圣草酚-iupac名称：(2s)-2-(3，4-二羟基苯基)-5，7-二羟基-4-苯并二氢吡喃酮。
具体实施方式
本文使用的术语解释：
定义：
细胞系统是提供异位蛋白表达的任何细胞。它包含细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。它包含原核和真核细胞。它还包含基于细胞组分(诸如核糖体)的蛋白的体外表达。
“编码序列”应给予本领域普通技术人员其普通和惯常的含义，并且无受限地用于指编码特定氨基酸序列的dna序列。
生长细胞系统。生长包含提供适当的介质，其将允许细胞繁殖和分裂。它还包含提供资源，以便细胞或细胞组分可以翻译并制造重组蛋白。
蛋白质表达。基因表达后可能会发生蛋白质生产。它由dna转录成信使rna(mrna)之后的阶段组成。然后将mrna翻译成多肽链，最终将其折叠成蛋白质。dna通过转染而存在于细胞中-这是故意将核酸引入细胞的过程。所述术语通常用于真核细胞中的非病毒方法。它也可以指其它方法和细胞类型，尽管优选其它术语：“转化”通常用于描述细菌、非动物真核细胞(包含植物细胞)中的非病毒dna转移。在动物细胞中，转染是优选的术语，因为转化也用于指这些细胞中进展为癌态(致癌作用)。转导通常用于描述病毒介导的dna转移。对于本申请，转化、转导和病毒感染包含在转染的定义下。
酵母。根据本发明，本文所要求保护的酵母是被分类为真菌界成员的真核单细胞微生物。酵母是由多细胞祖先进化而来的单细胞生物，但本发明中有用的一些物种是那些有能力通过形成连接的出芽细胞串而形成多细胞特性的物种，这些出芽细胞被称为伪菌丝或假菌丝。
结构术语：
如本文所使用，单数形式“一个、一种”和“所述”包含复数引用，除非内容另外明确指出。
在说明书或权利要求书中使用术语“包含”、“具有”等的程度时，所述术语旨在以与术语“包括”相似的方式被包含在内，因为当解释为“包括”时，在权利要求中被采用为过渡词。
单词“示例性”在本文中用来表示“起实例、事例或说明的作用”。本文中被描述为“示例性”的任何实施例不必被解释为比其它实施例优选或优势。
术语“互补的”应给予本领域普通技术人员其普通和惯常的含义，并且在使用时不局限于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于dna，腺苷与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，主题技术还包含与所附序列表中报道的完整序列互补的分离的核酸片段以及那些基本上相似的核酸序列。
术语“核酸”和“核苷酸”应给予本领域普通技术人员它们各自的普通和惯常含义，并且在使用时不局限于指脱氧核糖核酸或核糖核酸及其聚合物的单链或双链形式。除非特别限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合性质并且以与天然核苷酸相似的方式被代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含涵盖其保守修饰或简并的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。
术语“分离的”应给予本领域普通技术人员其普通和常规的含义，并且当用于分离的核酸或分离的多肽的上下文中时，使用但不局限于指核酸或通过人手在天然环境之外存在并因此不是自然产物的多肽。分离的核酸或多肽可以纯化形式存在或可以存在于非天然环境中，例如在转基因宿主细胞中。
如本文所用，术语“孵育(incubating)”和“孵育(incubation)”是指将两种或更多种化学或生物实体(诸如化合物和酶)混合并允许它们在有利于生产圣草酚组合物的条件下相互作用。
术语“简并变体”是指具有与参考核酸序列相差一个或多个简并密码子取代的残基序列的核酸序列。简并密码子取代可以通过产生序列来实现，其中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代。核酸序列及其所有简并变体将表达相同的氨基酸或多肽。
术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”应被赋予本领域普通技术人员它们各自的普通和习惯含义。这三个术语有时可以互换使用，并且无论其大小或功能如何，均无限制地用于指氨基酸或氨基酸类似物的聚合物。尽管“蛋白质”通常用于指相对较大的多肽，而“肽”通常用于指较小的多肽，但是这些术语在本领域中的使用是重叠的并且是变化的。除非另有说明，否则本文所用的术语“多肽”是指肽、多肽和蛋白质。当涉及多核苷酸产物时，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用。因此，示例性多肽包含多核苷酸产物、天然存在的蛋白质、同系物、直系同源物、旁系同源物、片段和前述的其它等同物、变体和类似物。
当使用参考多肽时，术语“多肽片段”和“片段”应被给予本领域普通技术人员其普通和惯常的含义，并且在不局限于此的情况下被用于指多肽。与参考多肽自身相比，那些氨基酸残基被删除，但是其中其余氨基酸序列通常与参照多肽中的相应位置相同。此类缺失可发生在参考多肽的氨基末端或羧基末端，或二者皆有。
术语多肽或蛋白质的“功能片段”是指作为全长多肽或蛋白质的一部分的肽片段，并且具有与全长多肽或蛋白质基本相同的生物学活性或执行与全长多肽或蛋白质相同的功能(例如进行相同的酶促反应)。
可互换使用的术语“变体多肽”、“修饰的氨基酸序列”或“修饰的多肽”是指与参考多肽相差一个或多个氨基酸，例如一个或多个氨基酸的替换、缺失和/或添加。一方面，变体是“功能变体”，其保留了参考多肽的一些或全部能力。
术语“功能变体”进一步包含保守取代的变体。术语“保守取代的变体”是指具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参考肽的区别在于一个或多个保守氨基酸取代，并维持所述参考肽的一些或全部活性。“保守氨基酸取代”是用功能相似的残基取代氨基酸残基。保守取代的实例包含一个非极性(疏水)残基，诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸对另一个的取代；一个带电或极性(亲水)残基对另一个的取代，诸如在精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、苏氨酸和丝氨酸之间；一个碱性残基，诸如赖氨酸或精氨酸对另一个的取代；或者一个酸性残基，诸如天冬氨酸或谷氨酸对另一个的取代；或一个芳香族残基，诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸对另一的取代。预期这种取代对蛋白质或多肽的表观分子量或等电点几乎没有影响。短语“保守取代的变体”还包含其中残基被化学衍生的残基替代的肽，条件是所得肽保持本文所描述的参考肽的一些或全部活性。
结合本技术的多肽，术语“变体”进一步包含具有至少75％、至少76％、至少77％，至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％及甚至100％与参照多肽的氨基酸序列相同的氨基酸序列的功能活性多肽。
所有语法形式和拼写变化形式的术语“同源”是指拥有“共同进化起源”的多核苷酸或多肽之间的关系，包含来自超级家族的多核苷酸或多肽和来自不同物种的同源多核苷酸或蛋白质(reeck等人，《细胞》50：667，1987)。这种多核苷酸或多肽具有序列同源性，如其序列相似性所反映的，无论是在同一性百分比上，还是在保守位置上存在特定氨基酸或基序。例如，两个同源多肽可具有至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％及甚至100％相同的氨基酸序列。
“合适的调控序列”应被给予本领域普通技术人员其普通和惯常的含义，并且在使用时不局限于指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、之内或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，并影响相关编码序列的转录、rna加工或稳定性或翻译。调控序列可以包含启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。
“启动子”应被给予本领域普通技术人员其普通和惯常的含义，并且被使用但不局限于指能够控制编码序列或功能性rna表达的dna序列。通常地，编码序列位于启动子序列的3′。启动子可以整体地源自天然基因，或由源自自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包括合成的dna片段。本领域技术人员应理解，不同的启动子可以指导基因在不同的组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应于不同的环境条件而表达。导致基因在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。进一步认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的dna片段可能具有相同的启动子活性。
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的缔合，从而一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响所述编码序列的表达时(即，所编码序列在所述启动子的转录控制之下)，则所述启动子与所述编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义方向可操作地连接至调节序列。
本文所用的术语“表达”应给予本领域普通技术人员其常规和惯常的含义，并且在使用时不局限于指源于主题技术的核酸片段的有义(mrna)或反义rna的转录和稳定积累。“过表达”是指基因产物在转基因或重组生物中的产量超过正常或非转化生物中的产量水平。
“转化”应给予本领域普通技术人员其普通和惯常的含义，并且在使用时不局限于指将多核苷酸转移到靶细胞中。可以将转移的多核苷酸并入靶细胞的基因组或染色体dna中，从而产生遗传稳定的遗传，或者可以独立于宿主染色体进行复制。含有转化的核酸片段的宿主生物可以被称为“转基因的”。
当在本文中与宿主细胞结合使用时，术语“转化的”、“转基因的”和“重组的”应给予本领域普通技术人员它们各自的普通和惯常意义，并且在不局限于指宿主生物的细胞，诸如植物或微生物细胞，其中已引入异源核酸分子。所述核酸分子可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中，或者所述核酸分子可以作为染色体外的分子存在。这种染色体外的分子可以自动复制。转化的细胞、组织或受试者被理解为不仅包含转化过程的终产物，而且还包含其转基因子代。
当本文与多核苷酸结合使用时，术语“重组”、“异源”和“外源”应被给予本领域普通技术人员其普通和惯常的含义，并且在使用时不局限于指源自特定宿主细胞外源的多核苷酸(例如，dna序列或基因)，或者如果来自相同来源，则从其原始形式进行修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包含特定宿主细胞内源的基因，但是已经通过例如使用定点诱变或其它重组技术进行修饰。所述术语还包含天然存在的dna序列的非天然存在的多个拷贝。因此，所述术语指与细胞外源或异源，或与细胞同源，但在宿主细胞内通常不存在所述元件的位置或形式的dna片段。
类似地，术语“重组”、“异源”和“外源”在本文中与多肽或氨基酸序列结合使用时，是指源自特定宿主细胞外源的多肽或氨基酸序列，或如果来自相同来源，则从其原始形式进行修饰。因此，重组dna片段可以在宿主细胞中表达以产生重组多肽。
术语“质粒”、“载体”和“基因盒”应给予本领域普通技术人员各自的普通和惯常含义，并且在使用时不局限于指通常携带基因的额外染色体元件，所述基因携带不是细胞中央代谢的一部分，通常以环状双链dna分子的形式存在。这样的元件可以是源自任何来源的单链或双链dna或rna的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列(线性或环状)，其中许多核苷酸序列已被连接或重组成一个独特的结构，所述结构能够将所选基因产物的启动子片段和dna序列以及适当的3′非翻译序列引入细胞中。“转化基因盒”是指含有外源基因并且除外源基因外还具有促进特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达基因盒”是指含有外源基因并且除外源基因外还具有允许所述基因在外源宿主中增强表达的元件的特定载体。
详细说明
合成生物学
本文使用的标准重组dna和分子克隆技术是本领域众所周知的，且由以下文件描述，例如sambrookj.、fritsche.f.和maniatist.《分子克隆：实验室手册》第二版；coldspringharborlaboratory：coldspringharbor，n.y，1989(以下称“maniatis”)；和silhavyt.j.、bennanm.l.和enquistl.w.《基因融合实验》；coldspringharborlaboratory：coldspringharbor，n.y，1984；及ausubelf.m.等人，《分子生物学当前方案》，由greenepublishingandwiley-interscience于1987年出版；(其全部内容通过引用并入本文)。
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料都可以用于本公开的实践或测试中，但是优选的材料和方法在下面进行描述。
通过考虑以下非限制性实例，将更充分地理解本公开。应当理解，这些示例虽然指示了本技术的优选实施例，但是仅以说明的方式给出。根据以上讨论和这些实例，本领域技术人员可以确定本技术的本质特征，并且在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对本技术进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。
材料和方法
细菌菌株、质粒和培养条件。
dh5a和bl21(de3)大肠杆菌菌株购自invitrogen，并且质粒prsfduet-1和pcdfduet-1购自novagen，用于dna克隆和重组蛋白表达。
dna操作。
所有dna操作均根据标准程序执行。限制性酶和t4dna连接酶购白新英格兰生物实验室。根据制造商的指导，所有pcr反应均使用新英格兰生物实验室的phusionpcr系统执行。
靶基因的鉴定
sam5是一种来自西班牙糖丝菌的4-香豆酸3-羟化酶，其ncbi参考序列id为wp_015103234.1，首次对其功能表征以催化对香豆酸向咖啡酸的间羟基化(berner等人2006)。密码子优化后在genscript公司中合成了其相应的核苷酸，用于在大肠杆菌中表达(序列id#1)。为了鉴定潜在有趣的黄素还原酶基因，使用关键词“黄素还原酶”在ncbi数据库中搜索假单胞菌荧光pf-5和西班牙糖丝菌中的蛋白，产生了两个同源物pffr和sefr，分别为基因库idaay92875.1和ncbi参考序列wp_041313262。它们的相应核苷酸序列是用在大肠杆菌中表达而优化的密码子生成的，并在genscript(nj)中合成。编码黄素还原酶的hpac是大肠杆菌中的4-羟苯基乙酸羟化酶复合物的组分(galan等人2000)，所述研究也包含在内。
质粒的构建。
对sam5的dna片段和两种未表征的黄素还原酶ppfr和sefr进行密码子优化，以分别用seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5中列出的序列进行大肠杆菌表达。天然hpacdna序列在seqid#7中列出。它们相应的蛋白质序列分别列在seqidno.2、seqidno.4、seqidno.6和seqidno.8中。在genscript公司中合成了sam5、ppfr和sefr，并用作随后pcr扩增的模板。
将sam5克隆到prsfduet-1的ndei/xhoi限制位点。将ppfr、sefr和hpac克隆到pcdfduet-1的ndei/xhoi限制位点中。为了酶的过表达和纯化，将hpac、ppfr和sefr克隆到pet28a载体的ndei/xhoi限制位点。
使用细菌dna提取试剂盒从大肠杆菌菌株mg1655的基因组dna中克隆hpac。hpac基因通过pcr从大肠杆菌基因组dna中扩增，在5′端引入ndei位点，在3′端引入xhoi位点。使用的引物是正向引物hpac_ndei_f(5′-gggaattccatatgcaattagatgagaaaaacgcctgcg)和反向引物hpac_xhoi_r(5′-ctcgagcggttaaatcgcagcttccatttccagc)。用ndei和xhoi消化的pcr产物与用相同酶消化的质粒pcdfduet-1连接，并转化到大肠杆菌dh5a中。从具有阳性插入片段的菌落中提取质粒hpac-pcdf，并通过测序确认。
为了用sam5操纵子和特定的黄素还原酶构建构建体，通过gibson组装将特定的黄素还原酶基因插入sam5的下游，产生三个构建体，分别命名为sam5-hpac-prsf、sam5-ppfr-prsf和sam5-sefr-prsf。
用已开发的构建体转化大肠杆菌bl21(de3)。
通过标准化学转化方案将sam5-prsf导入大肠杆菌bl21(de3)细胞，从而开发出产生圣草酚的大肠杆菌菌株，称为eri-01。根据标准程序，分别将sam5-prsf与pcdfduet-1、ppfr-pcdf、sefr-pcdf和hpac-pcdf共转化为bl21(de3)，生成相应的生产圣草酚的大肠杆菌菌株eri-02、eri-03、eri-04和eri-05。将具有构建的操纵子的三个质粒sam5-hpac-prsf、sam5-ppfr-prsf和sam5-sefr-prsf分别转化到bl21(de3)中，产生三个大肠杆菌菌株eri-06、eri-07和eri-08。
hpac、ppfr和sefr在大肠杆菌中的过表达和纯化
将质粒hpac-pet28a、ppfr-pet28a和sefr-pet28a分别转化到bl21(de3)感受态细胞中，以标准程序表达异源蛋白质。每种转化的单个菌落在37℃的5ml含50mg/l卡那霉素的lb培养基中生长，直到od600达到约1.0，然后将这些种子培养物转移到200ml含50mg/l卡那霉素的lb培养基中。使细胞在37℃以250rpm生长至od600为0.6-0.8，然后添加iptg至终浓度为0.5mm，并且将生长温度改变为16℃。iptg诱导16小时后，收集大肠杆菌细胞，通过在4℃下以4000g离心15分钟纯化蛋白。将得到的沉淀重悬于5ml的100mmtris-hcl(ph7.4)、100mmnaoh、10％甘油(v/v)中，并在冰上超声处理2分钟。将混合物在4℃以4000g离心20分钟。根据制造商的方案，使用clontechinc的his60ni超流动树脂纯化上清液中的重组蛋白。
黄素还原酶活性测量
通过使用spectramaxi3在30℃下测量340nm的吸光度变化来确定黄素还原酶的活性。将固定量的纯化蛋白(分别为0.1μg)与400μmnadh和200μmfad在反应缓冲液(tris-hcl20mm(ph7.4)，最终体积100μl)中孵育。没有fad的测定混合物用作空白。
柚皮素生物转化为圣草酚
根据本发明，我们开发了一种系统，所述系统与sam5一起过表达黄素还原酶，从而使本发明的修饰的微生物菌株能够高效地催化柚皮素转化为圣草酚。摇瓶中的滴度在6小时内达到0.65g/l。利用的微生物系统是在含有30μg/l卡那霉素的lb培养基中生长大肠杆菌bl21(de3)菌株eri-01、eri-06、eri-07、eri-08和prsf-blk；eri-02、eri-03、eri-04和eri-05在分别含有30μg/l卡那霉素和100μg/l大观霉素的lb培养基中生长。使细胞在37℃下在摇床上生长至od600＝0.6，然后在添加乳糖至终浓度为1.5％(w/v)的情况下改变至30℃以诱导外源基因的表达。表达诱导3小时后，将溶于dmso的柚皮素(40％w/v)加入培养基中。在相同的培养条件下保持培养基摇动。在底物进料后6小时取样以进行hplc分析。
hplc和lc-ms分析。
类黄酮的hplc分析是用dionexultimate3000系统进行的。在dionexacclaim120c18色谱柱(粒径3mm；150x2.1mm)上，通过反相色谱分离中间体，并用0.15％(vol/vol)的乙酸(洗脱液a)和乙腈(洗脱液b)进行梯度洗脱。洗脱液b的浓度范围为10％至40％(体积/体积)，流速为0.6ml/min。对于定量，所有中间体均用外标。通过它们的保留时间以及相应的光谱来鉴定所述化合物，这些光谱是用系统中的二极管阵列检测器鉴定的。
dh5a和bl21(de3)大肠杆菌菌株购自invitrogen，并且质粒prsfduet-1和pcdfduet-1购自novagen，用于dna克隆和重组蛋白表达。
生产系统
在一个实施例中，表达载体包含用于在细菌细胞中表达重组多肽的那些遗传元件。在细菌细胞中用于转录和翻译的元件可以包含启动子、蛋白复合物的编码区和转录终止子。
本领域普通技术人员将知道可用于制备表达载体的分子生物学技术。如上所述，用于并入本技术的表达载体中的多核苷酸可以通过诸如聚合酶链反应(pcr)的常规技术来制备。在分子克隆中，载体是一种dna分子，用作将外来遗传物质人工携带到另一个细胞中的媒介物，可以在其中复制和/或表达它(例如-质粒、粘粒、λ噬菌体)。含有外源dna的载体被认为是重组dna。四种主要类型的载体是质粒、病毒载体、粘粒和人工染色体。其中最常用的载体是质粒。所有工程载体的共同点是复制起点、多克隆位点和选择标记物。
已经开发了许多分子生物学技术以经由互补的粘性末端将dna与载体有效连接。在一实施例中，互补均聚物束可以添加到核酸分子中，以插入到载体dna中。然后，载体和核酸分子通过互补均聚物尾部之间的氢键结合而形成重组dna分子。
在一个可选的实施例中，含有一个或多个限制性位点的合成连接子被用于将本技术的多核苷酸可操作地连接至表达载体。在一个实施例中，通过限制性核酸内切酶消化产生多核苷酸。在一个实施例中，用噬菌体t4dna聚合酶或大肠杆菌dna聚合酶i处理核酸分子，所述酶去除具有3′-5′外切核酸活性的突出的3′-单链末端，并填充凹陷的3′-末端(具有其聚合活性)，从而产生钝末端dna片段。然后在能够催化钝末端dna分子(诸如噬菌体t4dna连接酶)连接的酶的存在下，将钝末端片段与大量摩尔过量的连接子分子一起孵育。因此，反应产物是在其末端带有聚合物连接子序列的多核苷酸。然后将这些多核苷酸用适当的限制酶切割，并连接至已经用产生与所述多核苷酸的末端相容的末端的酶切割的表达载体。
或者，可以使用具有连接非依赖性克隆(lic)位点的载体。然后可以将所需的pcr扩增的多核苷酸克隆到lic载体中，而无需进行限制性酶切或连接(aslanidis和dejong，《核酸研究》186069-74，(1990)、haun等人，《生物技术》13，515-18(1992)，其每一个均通过引用并入本文)。
在一个实施例中，为了分离和/或修饰目的多核苷酸以插入选择的质粒中，使用pcr是合适的。可以设计用于pcr制备序列的适当引物，以分离核酸分子的所需编码区，添加限制性核酸内切酶或lic位点，将编码区置于所需的阅读框中。
在一个实施例中，使用pcr适当的寡核苷酸引物制备用于并入本技术的表达载体的多核苷酸。扩增编码区，而引物本身被并入扩增的序列产物中。在一个实施例中，扩增引物含有限制性核酸内切酶识别位点，其允许将扩增的序列产物克隆到适当的载体中。
可以通过常规转化或转染技术将表达载体导入植物或微生物宿主细胞。用本领域技术的表达载体转化适当的细胞是通过本领域已知的方法完成的，并且通常取决于载体和细胞的类型。合适的技术包含磷酸钙或氯化钙共沉淀，deae-葡聚糖介导的转染、脂质转染、化学穿孔或电穿孔。
可以通过本领域众所周知的技术鉴定成功转化的细胞，即含有表达载体的那些细胞。例如，可以培养用本技术的表达载体转染的细胞以产生本文所述的多肽。可以通过本领域众所周知的技术检查细胞中表达载体dna的存在。
宿主细胞可以含有先前描述的表达载体的单个拷贝，也可以含有表达载体的多个拷贝。
在一些实施例中，转化的细胞是动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞或酵母细胞。在一些实施例中，细胞是选自由菜籽油植物细胞、油菜籽植物细胞、棕榈植物细胞、向日葵植物细胞、棉花植物细胞、玉米植物细胞、花生植物细胞、亚麻植物细胞、芝麻植物细胞、大豆植物细胞和矮牵牛植物细胞组成的组的植物细胞。
微生物宿主细胞表达系统和表达载体，其含有指导外源蛋白高水平表达的调节序列，这是本领域技术人员众所周知的。这些中的任何一种都可以用于构建载体以在微生物宿主细胞中表达本主题技术的重组多肽。然后可以经由转化将这些载体导入适当的微生物中，以允许本技术的重组多肽的高水平表达。
可用于转化合适的微生物宿主细胞的载体或基因盒是本领域众所周知的。通常，载体或基因盒含有指导相关多核苷酸的转录和翻译的序列，选择标记物以及允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括具有转录起始控制的多核苷酸的区域5′和控制转录终止的dna片段的区域3′。优选的是，两个控制区均源自与转化的宿主细胞同源的基因，尽管应理解的是，此类控制区不必源自被选作宿主的特定物种的天然基因。
终止控制区也可以源自微生物宿主天然的各种基因。对于本文所述的微生物宿主，可以任选地包含终止位点。
本发明类黄酮的生物合成和用途
本领域技术人员将认识到，通过本文所述的方法生产的圣草酚组合物可以进一步纯化，并与其它营养食品以及药物中的膳食补充剂、药物组合物、药用化妆品混合。
使用同一性评分的序列相似性分析
如本文所使用，“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)的比对窗口中不变的程度。测试序列和参考序列的比对片段的“同一性部分”是两个比对序列所共有的相同组分的数量除以参考序列片段中的组分总数，即整个参考序列或参考序列的较小定义部分。
如本文所使用，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指当两个序列最佳比对时(在比较窗口中，适当的核苷酸插入、缺失或间隔合计少于参考序列的20％)，与测试(“受试者”)多核苷酸分子(或其互补链)相比，参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中相同核苷酸的百分比。用于比对比较窗口的序列的最佳比对是本领域技术人员众所周知的，并且可以通过诸如smith和waterman的局部同源性算法、needleman和wunsch的同源性比对算法、pearson和lipman的的相似性方法的搜索之类的工具来进行，且最好是通过这些算法的计算机化实现方式，例如gap、bestfit、fasta和tfasta，它们可以作为
序列同一性的百分比优选地使用sequenceanalysissoftwarepackagetm(版本10；geneticscomputergroup，inc.，madison，wi)的“bestfit”或“gap”程序来确定。“gap”利用needleman和wunsch的算法(needleman和wunsch，《分子生物学杂志(journalofmolecularbiology)》48：443-453，1970)找到两个序列的比对，该比对最大化匹配数而最小化间隔数。“bestfit”使用smith和waterman当地同源性算法执行两个序列之间最佳相似片段的最佳比对，并插入间隔以最大化匹配数(smith和waterman，《应用数学进展(advancesinappliedmathematics)》，2：482-489，1981、smith等人《核酸研究(nucleicacidsresearch)》11：2205-2220，1983)。同一性百分比最优选使用“bestfit”程序确定。
确定序列同一性的有用方法还公开在基本局部比对搜索工具(blast)程序中，所述程序可从马里兰州(20894)贝塞斯达市国立卫生研究院国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(ncbi)公开获得；参见altschul等人《blast手册(blastmanual)》，ncbi，nlm，nih；altschul等人，《分子生物学杂志(j.mol.biol)》.215：403-410(1990)；blast程序2.0版或更高版本允许将间隔(缺失和插入)引入比对中；对于肽序列，blastx可用于确定序列同一性；且对于多核苷酸序列，blastn可用于确定序列同一性。
如本文所使用，术语“实质上的序列同一性百分比”是指至少约70％的序列同一性、至少约80％的序列同一性、至少约85％的同一性、至少约90％的序列同一性，或甚至更高的序列同一性，诸如约98％或约99％的序列同一性的序列同一性百分比。因此，本发明的一个实施例是一种多核苷酸分子，其具有与本文描述的多核苷酸序列至少约70％的序列同一性、至少约80％的序列同一性、至少约85％的同一性、至少约90％的序列同一性，或甚至更高的序列同一性，诸如约98％或约99％的序列同一性。具有本发明的活性基因的多核苷酸分子能够指导生产圣草酚，并且与本文提供的多核苷酸序列具有实质上的序列同一性百分比，并且包含在本发明的范围内。
同一性和相似性
同一性是指序列比对后一对序列之间相同的氨基酸部分(可以仅使用序列信息或结构信息或其它信息来完成，但通常仅基于序列信息即可)，相似性是基于使用一些相似性矩阵的比对分配的分数。相似性指数可以是以下blosum62、pam250或gonnet中的任何一种，或者是本领域技术人员用于蛋白质序列比对的任何矩阵。
同一性是两个子序列之间的对应程度(序列之间没有间隔)。25％或更高的一致性表示功能相似性，而18-25％的一致性表示结构或功能相似性。请记住，两个完全不相关或随机的序列(大于100个残基)可能具有20％以上的同一性。相似性是两个序列之间对比时的相似程度。这取决于它们的同一性。
从前述描述中显而易见的是，本公开的某些方面不受本文提供的实例的特定细节的限制，并且因此可以预期，本领域技术人员将想到其它修改和应用或其等同形式。因此，意图是权利要求将覆盖不脱离本公开的精神和范围的所有这样的修改和应用。
此外，除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的方法或材料的任何方法和材料都可以用于本公开的实践或测试，但是优选的方法和材料如上所述。
尽管为了理解的目的已经通过图示和示例的方式详细地描述了前述发明，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以进行某些改变和修改。因此，说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求限定。
结果
柚皮素生物转化为圣草酚中的sam5活性
如图1所示，将sam5插入prsfduet-1的第二个多克隆位点。基因表达在t7启动子的控制下。当将质粒sam5-prsf导入bl21(de3)时，细胞具有将培养基中加入的柚皮素转化为圣草酚的能力，而在对照菌株eri-ctrl中，不含sam5的prsfduet-1质粒中未产生圣草酚。如hplc图谱所示，将柚皮素加入细胞培养基中后，产生了少量新化合物。所述化合物在hplc分析中的保留时间与圣草酚的吸收光谱相对应。如图3所示，通过hplc分离的峰的进一步分析证实了柚皮素生物转化为圣草酚。
ppfr和sefr是黄素还原酶。
hpac编码黄素还原酶，是大肠杆菌中的4-羟苯基乙酸羟化酶复合物的组分(galan等人2000)。在我们的研究中，还从ncbi数据库中鉴定了另外两个基因ppfr和sefr。序列分析显示，两者均与hpac具有较低的同一性，分别为22.9％和30.2％。然而，这三种蛋白中的每一种都拥有s/t/cxxpp和dgh共有基序特征的i类黄酮还原酶的hpac样亚家族(图4)。因此，ppfr和sefr被注释为i类黄素还原酶的hpac样亚家族的成员(vanlanen等人2009)。将这三个基因分别克隆到pet28a载体中(图7)，并导入大肠杆菌bl21(de3)中进行过表达。重组蛋白在大肠杆菌中表达，并纯化至同质(图5)用于生化分析。结果清楚地证实了上述生物信息学分析。如hpac，ppfr和sefr使用nadh催化还原fad，并且ppfr和sefr的比活性与hpac相当(图6)。
黄素还原酶通过sam5显著增加柚皮素至圣草酚的生物转化。
当hpac-pcdf与sam5-prsf在大肠杆菌细胞中共表达时，所得的工程化细胞eri-03可以将柚皮素转化为具有更高活性的体内圣草酚。如图8所示，与单独的sam5相比，生成的圣草酚要更高的水平。er03菌株的圣草酚产量在6小时内达到0.285g/l，分别比eri-01和eri-02菌株高6.3倍和7.5倍(图9)。ppfr和sefr也显示出对sam5的刺激作用。eri-04和eri-05显示具有较高的催化柚皮素羟基化作用的能力，从而产生圣草酚。如图9所示，分别在eri-04和eri-05中加入柚皮素后6个小时，在细胞培养基中，圣草酚积累到357mg/l和388mg/l。与eri03相比，eri-04和eri-05产生的圣草酚的滴度分别提高了25％和36％(图9)。该结果表明，ppfr和sefr可能更有效地促进sam5催化的柚皮素的羟基化。
sam5的操纵子和黄素还原酶进一步增加了柚皮素向圣草酚的生物转化
如图8所示，产生的erio-02菌株的圣草酚低于eri-01菌株，这可能是由共表达菌株使用的两种抗体引起。在表达载体中将sam5和黄素还原酶构建为操纵子(图9)。测试了所得的大肠杆菌菌株eri-06、eri07和eri-08的柚皮素的生物转化。如图11所示，滴度达到589mg/l、614mg/l和638mg/l，显著地高于相应的共表达菌株。
药妆和补冲剂使用
分子生物学在创新药妆中起着关键作用。现如今，化合物鉴定始于分子靶标的鉴定。例如，自由基与皮肤衰老相关的重要性近年来导致对活性物质的深入研究，所述活性物质消除了自由基的有害作用并因此保护组织免受氧化损伤。皮肤衰老表现为老年斑，更具体地为黄褐斑、色素减退、黑色素瘤和皱纹，主要归因于自由基对组织的损伤，从而触发结构蛋白的交联和糖基化以及促炎性酶系统。类黄酮在化妆品或药品中的使用本身是众所周知的。淬灭自由基的天然抗氧化剂(诸如本发明的圣草酚)，是抗衰老制剂的基本组分。它们潜在地提供保护、防止组织损伤，以及免受环境和其它因素的有害影响。加速皮肤衰老进程的生化反应源于炎症过程，因为炎症会产生微疤痕，并逐渐发展为斑点或皱纹。
已知本文讨论的这些黄酮和黄酮糖苷衍生物(类黄酮)是氧自由基的清除剂和皮肤蛋白酶的抑制剂，因此它们能够有效地对抗皮肤的老化和疤痕形成。由于它们的着色性质，诸如槲皮素的一些黄酮也可用作食品着色剂。同时，它们捕获氧自由基的能力也使它们可用作抗氧化剂。一些类黄酮是醛糖还原酶的抑制剂，其在糖尿病损伤(例如：血管损伤)的形成中起关键作用。其它类黄酮(诸如橙皮苷和芦丁)可用于治疗，尤其是用作血管扩张毛细血管活性剂。
科学研究已经证实类黄酮化合物对皮肤的各种水平都有广泛影响。皮肤的最上层，即角质层是一种非常富含脂质和其它易氧化化合物的结构。在这一层中，类黄酮可以起有效的抗氧化剂和自由基清除剂的作用。它们的抗氧化性质使它们能够影响更深的表皮皮肤层，防止紫外线辐射损害并抑制某些酶功能。在真皮(最深的皮肤层)中，类黄酮会影响微血管系统的渗透性和脆弱性。所述的类黄酮的有价值的特征已经使其在化妆品行业中有价值。
工业适用性声明/技术领域
本公开在食品、饲料、药妆和药理学行业中具有适用性。本公开总体上涉及一种经由修饰的微生物菌株生物合成生产圣草酚的方法。
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25.
相关序列
seqidno.1：sam5的核酸序列
seqidno.2sam5的氨基酸序列
seqidno.3sefr的核酸序列
seqidno.4sefr的氨基酸序列
seqidno.55pffr的核酸序列
seqidno.6pffr的氨基酸序列
seqidno.7hpac的核酸序列
seqidno.8hpac的氨基酸序列
1.一种用核酸构建体转化的分离的重组宿主细胞，所述核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的编码黄素还原酶的多核苷酸序列，其中所述黄素还原酶能够指导柚皮素生物转化为羟基化类黄酮。
2.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其进一步包括载体，所述载体含有seqidno：1、3、5和7的分离的核酸序列。
3.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其进一步包括载体，所述载体含有seqidno：1和3的分离的核酸序列。
4.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其进一步包括载体，所述载体含有seqidno：1和5的分离的核酸序列。
5.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其进一步包括载体，所述载体含有seqidno：1和7的分离的核酸序列。
6.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其进一步包括seqidno：3的分离的核酸序列。
7.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其中所述多核苷酸包括与seqidno：3的dna序列至少90％相同的序列。
8.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其进一步包括seqidno：5的分离的分离的核酸序列。
9.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其中所述多核苷酸包括与seqidno：5的dna序列至少90％相同的序列。
10.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其进一步包括seqidno：7的分离的分离的核酸序列。
11.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其中所述多核苷酸包括与seqidno：7的dna序列至少90％相同的序列。
12.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其中所述黄素还原酶包括氨基酸序列，所述氨基酸序列与来自seqidno：4的氨基酸连续序列至少约90％相同。
13.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其中所述黄素还原酶包括氨基酸序列，所述氨基酸序列与来自seqidno：6的氨基酸连续序列至少约90％相同。
14.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其中所述黄素还原酶包括氨基酸序列，所述氨基酸序列与来自seqidno：8的氨基酸连续序列至少约90％相同。
15.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其中所述羟基化的类黄酮是圣草酚。
16.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其中所述分离的重组细胞选自由细菌、酵母、丝状真菌、蓝藻藻类和植物细胞组成的组。
17.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其中所述分离的重组细胞选自由以下各项组成的组：埃希氏菌；沙门氏菌；芽孢杆菌；不动杆菌；链霉菌；棒状杆菌；甲基弯曲菌；甲基单胞菌；红球菌；假单胞菌；红细菌；集胞藻；酵母菌；接合酵母菌；克鲁维酵母菌；念珠菌；汉逊酵母；德巴利氏酵母；毛霉菌；毕赤酵母；球拟酵母；曲霉真菌；丛孢菌；短杆菌；微杆菌；节细菌；柠檬酸杆菌；埃希氏菌；克雷伯氏菌；泛菌；沙门氏菌；棒状杆菌；梭菌以及丙酮丁醇梭菌。
18.一种生产圣草酚组合物的方法，所述方法包括将根据权利要求15所述的分离的重组宿主细胞与底物一起孵育。
19.一种通过根据权利要求18所述的方法生产的圣草酚组合物。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述底物是柚皮素组合物，并且柚皮素被羟基化以酶促形成圣草酚。
21.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其中所述分离的重组细胞选自由酵母、不产生圣草酚的植物、藻类和细菌组成的组。
22.根据权利要求16所述的分离的重组细胞，其中所述分离的重组细胞是大肠杆菌细胞。
23.一种低热量饮料产品，其包括：水；非营养性甜味剂组分，其包括具有回味的甜余味的非营养性甜味剂；以及一种苦味剂组分，其量有效地减少了所述非营养性甜味剂的所述回味的甜余味，其中所述苦味剂是通过根据权利要求18所述的方法生产的圣草酚。
24.根据权利要求23所述的低热量饮料，其中所述苦味剂组分的浓度在万亿分之50至百万分之500之间。
25.根据权利要求23所述的低热量饮料，其进一步包括莱鲍迪甙m。
26.一种在化妆品或卫生产品中使用天然化合物的方法，所述方法包括以下步骤：从微生物宿主细胞生产圣草酚，并通过将所述圣草酚与化妆品或卫生学上活性物质结合来制造化妆品或卫生产品以提供理想的皮肤、头发或口腔护理作用。
27.一种通过根据权利要求26所述的方法生产的化妆品或卫生组合物。
28.根据权利要求27所述的化妆品或卫生组合物，其中所述组合物具有强的抗炎活性。
29.根据权利要求28所述的化妆品或卫生组合物，其中所述组合物用作生物利用度增强剂。
30.根据权利要求29所述的化妆品或卫生组合物，其进一步包括维生素c。
31.根据权利要求29所述的化妆品或卫生组合物，其中所述组合物具有自由基分解作用，使得所述组合物减少由自由基引起的皮肤损伤、头发损伤和口腔损伤中的至少一种。
32.根据权利要求26所述的方法，其中将所述圣草酚组分纯化至至少50％的纯度。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述圣草酚的纯度大于70％。
34.根据权利要求26所述的方法，其中以干重计，所述圣草酚含量大于约85重量％。
35.根据权利要求18所述的方法，其进一步包括：i)从所述分离的重组细胞中纯化所述圣草酚以产生粗产物；以及ii)在真空下去除溶剂，得到浓缩的圣草酚产品。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述粗产物通过柱色谱法纯化。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述粗产物通过酸碱提取纯化。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述粗产物通过真空蒸馏纯化。
39.根据权利要求35所述的方法，其进一步包括使用半制备型hplc纯化所述圣草酚。
40.根据权利要求18所述的方法，其中所述分离的重组宿主细胞是大肠杆菌细胞，并且所述方法进一步包括在所述大肠杆菌细胞中共表达hpac与sam5，其中所得细胞将柚皮素转化为圣草酚。
41.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其中所述分离的重组细胞是巴斯德毕赤酵母细胞。
42.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其中所述分离的重组细胞是酿酒酵母细胞。
43.根据权利要求18所述的方法，其中生产的所述圣草酚组合物是圣草酚、松属素、高圣草酚或其组合。
44.根据权利要求19所述的圣草酚组合物，其中所述圣草酚化合物以钠盐或钾盐的形式配制在食品中，其含量为0.01至500ppm，并在不降低甜度的情况下降低或抑制食品风味的苦味。
45.根据权利要求44所述的圣草酚组合物，其中所述食品的甜味由甜叶菊莱鲍迪甙提供。
46.根据权利要求44所述的圣草酚组合物，其中所述圣草酚组合物伴有其它调味剂，其中所述调味剂选自包括三叶苷、樱花素、根皮素和橙皮素的组。
47.根据权利要求18所述的方法，其中所生产的所述圣草酚组合物能够抑制苦味，并且所述圣草酚组合物抑制的所述苦味是在选自由食品、营养食品、药品、消费型饮料、药物和口腔卫生产品组成的组的制备物中，任选地，其中所述方法进一步包括将所述圣草酚组合物添加至所述食品、营养食品、药品、消费型饮料、药物或口腔卫生产品中。
48.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其中所述分离的重组细胞是从选自由以下各项组成的组的植物分离的细胞：大豆；油菜；向日葵；棉花；玉米；烟草；苜蓿；小麦；大麦；燕麦；高粱；水稻；西兰花；菜花；卷心菜；防风草；甜瓜；胡萝卜；芹菜；香菜；番茄；土豆；草莓；花生；葡萄；草籽作物；甜菜；甘蔗；豆子；豌豆；黑麦；亚麻；硬木树；软木树；牧草；拟南芥；水稻(oryzasativa)；大麦；柳枝稷(panicumvigratum)；短柄草；芸苔；以及海甘蓝。
技术总结