本发明涉及一种用于检测尤其是天然存在的dna和rna的核碱基中的修饰的方法和相关的生物探针。
在我们之前的专利申请w02015121675中，我们已经描述了三组分生物探针的用途，该探针包含具有单链和双链寡核苷酸区域的第一组分和包括处于淬灭状态的不同荧光团的一对第二组分，以鉴定多核苷酸分析物中的给定单核苷酸的甲基化状态。在该方法中，在通过核酸外切以释放非猝灭状态的荧光团之前，先用甲基化依赖性或甲基化敏感性限制性核酸内切酶切割使用的探针。
我们现在已经开发出该方法的另一个版本，该版本不仅更广泛地适用于当前可用的一系列核碱基修饰和限制性核酸内切酶，而且更简单、更灵敏，并且产生更强的信号和更高的信噪比。因此，根据本发明的第一方面，提供检测分析物中给定的核苷三磷酸分子的核碱基是否包括给定化学或结构修饰的方法，其特征在于以下步骤：(1)在聚合酶存在下，使所述分析物与包含以下组分的生物探针反应：(a)一对单链第一寡核苷酸，其各自包含核酸外切酶封闭位点；位于所述封闭位点的5’侧的至少一个限制性核酸内切酶识别位点；位于所述识别位点内的单个核苷酸捕获位点以及分别位于所述识别位点5’侧的第一和第二荧光团，所述第一和第二荧光团被布置为基本上不可检测的，和(b)至少一个第二和任选地至少一个第三单链寡核苷酸，其各自与所述第一寡核苷酸分开并且能够与所述对中的一个、另一个或两个第一寡核苷酸的捕获位点的3’和5’侧的互补侧翼区域杂交，以产生由(b1)和(b2)组成的使用的探针双链体，其中，(b1)是所述对中的一个或另一个第一寡核苷酸，(b2)是包含所述第二寡核苷酸、源自所述核苷三磷酸分子的一个或其他个修饰的或未修饰的核苷酸以及任选地所述第三寡核苷酸的组分，其中所述双链体包含四个可能的(b1)/(b2)双链体排列中的一个；(2)将步骤(1)中产生的所述双链体与限制性核酸内切酶系统反应，所述限制性核酸内切酶系统包含至少一种适合于选择性地在所述识别位点切割所述(b1)链的限制性核酸内切酶，以根据原始的核苷三磷酸分子中是否存在所述修饰而产生(i)仅带有第一荧光团的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件或(ii)仅带有第二荧光团的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件或(iii)分别带有第一和第二荧光团的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件的混合物；(3)从所述(b2)组分和所述对中的又一个第一寡核苷酸产生又一个使用的探针双链体，然后迭代步骤(2)和(3)；(4)在步骤(2)或(3)中的任何一个或两个之后，用具有3’-5’核酸外切活性的酶消化所述第一寡核苷酸元件，以产生可检测状态的荧光团，以及(5)检测在步骤(4)中释放的所述荧光团，并从观察到的荧光信号的性质推断所述原始的单核苷三磷酸分子是否被修饰。
在本发明的第二个相关的方面，提供检测分析物中给定的核苷三磷酸分子的核碱基是否包括给定化学或结构修饰的方法，其特征在于以下步骤：(1)在聚合酶存在下，使所述分析物与包含以下组分的生物探针反应：(a)一对单链第一寡核苷酸，其各自包含核酸外切酶封闭位点；位于所述封闭位点的3’侧的至少一个限制性核酸内切酶识别位点；位于所述识别位点内的单个核苷酸捕获位点以及分别位于所述识别位点3’侧的第一和第二荧光团，所述第一和第二荧光团被布置为基本上不可检测的，和(b)至少一个第二和任选地至少一个第三单链寡核苷酸，其各自与所述第一寡核苷酸分开并且能够与所述对中的一个、另一个或两个第一寡核苷酸的捕获位点的3’和5’侧的互补侧翼区域杂交，以产生由(b1)和(b2)组成的使用的探针双链体，其中，(b1)是所述对中的一个或另一个第一寡核苷酸，(b2)是包含所述第二寡核苷酸、源自所述核苷三磷酸分子的一个或其他个修饰的或未修饰的核苷酸以及任选地所述第三寡核苷酸的组分，其中每个双链体包含四个可能的(b1)/(b2)双链体排列中的一个；(2)将步骤(1)中产生的所述双链体与限制性核酸内切酶系统反应，所述限制性核酸内切酶系统包含至少一种适合于选择性地在所述识别位点切割所述(b1)链的限制性核酸内切酶，以根据原始的核苷三磷酸分子中是否存在所述修饰而产生(i)仅带有第一荧光团的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件或(ii)仅带有第二荧光团的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件或(iii)分别带有第一和第二荧光团的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件的混合物；(3)从所述(b2)组分和所述对中的又一个第一寡核苷酸产生又一个使用的探针双链体，然后迭代步骤(2)和(3)；(4)在步骤(2)和(3)中的任何一个或两个之后，用具有5’-3’核酸外切活性的酶消化所述第一寡核苷酸元件，以产生可检测状态的荧光团；以及(5)检测在步骤(4)中释放的所述荧光团，并从观察到的荧光信号的性质推断所述原始的单核苷三磷酸分子是否被修饰。
此方法适用的分析物能够通过逐步酶消化从核酸前体方便地制备。在一个实施方案中，这可以通过前体的逐步核酸外切后接激酶对获得的单核苷一磷酸的作用来实现(见例如bao和ryu的生物技术和生物工程(doi10.1002/bit.21498))。然而，优选通过逐步焦磷酸解直接从前体产生分析物中的核苷三磷酸分子。在该步骤中采用的核酸前体合适地是单链或双链多核苷酸，其长度原则上可以是没有限制的，例如包括在人基因或染色体片段中发现的高达数百万个核苷酸。然而，通常，多核苷酸至少为50个，优选至少150个核苷酸长；适当地，它将大于500，大于1000并且在许多情况下数千个核苷酸长。核酸前体优选是天然来源(例如，源自植物、动物、细菌或病毒)的rna或dna，尽管该方法也可以用于分析完全合成或合成产生的。包括rna、dna或全部或部分由其相关核碱基在自然界中不常遇到(即除腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)之外的核碱基)的核苷酸构成的其他核酸。这种核碱基的实例包括4-乙酰基胞苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、2-o-甲基胞苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基-甲基尿苷、二氢尿苷、2-o-甲基假尿苷、2-o-甲基鸟苷、肌苷、n6-异戊基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、n6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、2-甲硫基-n6-异戊烯基腺苷、尿苷-5-氧基乙酸-甲酯、尿苷-5-氧基乙酸、wybutoxosine、怀丁苷(wybutosine)、假尿苷、辫苷、2-硫胞苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-甲基尿苷、2-o-甲基-5-甲基尿苷和2-o-甲基尿苷。在dna的情况下，生成的单核苷三磷酸是脱氧核糖核苷三磷酸，而在rna的情况下，它们是核糖核苷三磷酸。
在该方法的一个实施方案中，分析物的生成还包括将核酸前体附接至基质的第一子步骤。通常，此基质包括微流体表面、微珠或可渗透膜；例如，由玻璃或不可降解的聚合物制成的基质。优选地，基质还包括具体适于接收核酸前体的表面。有许多方法可以将核酸前体附接到这样的表面上，其中任何一个原则上都可以用在这个子步骤中。例如，一种方法涉及用官能化硅烷诸如环氧硅烷、氨基烃基硅烷或巯基硅烷涂布(priming)玻璃表面。然后可以用核酸前体的衍生物处理如此生成的反应位点，所述核酸前体的衍生物已被修饰以包括反应性的末端胺、琥珀酰基或硫醇基。
在又一个实施方案中，将核酸前体焦磷酸解以生成包含单核苷三磷酸分子的流的分析物，其顺序对应于分析物序列的顺序。这种焦磷酸解可以在例如包含显示这种酶促行为的合适的聚合酶的反应介质的存在下，在20至90℃的温度下进行。优选地，它在连续流动的条件下进行，使得单核苷三磷酸分子释放时连续地从反应区中除去。最优选地，焦磷酸解通过使含有酶和其它典型添加剂的含水缓冲介质连续流经核酸分析物所结合的表面来进行。
在再又一个实施方案中，使用的酶是可以引起核酸前体的逐步的3’-5’焦磷酸解消化以产生具有高保真度和合理反应速率的核苷三磷酸分子流的酶。优选地，该消化速率尽可能快，并且在一个实施方案中，其为每秒1至50个核苷三磷酸分子。关于应用于多核苷酸消化的焦磷酸解反应的进一步信息可以在例如读者所指向的j.biol.chem.244(1969),3019-3028页中找到。合适地，焦磷酸解消化在介质存在下进行，该介质进一步包含例如焦磷酸根阴离子和镁阳离子；优选以毫摩尔浓度。此消化之后，将含有释放的核苷三磷酸的溶液用焦磷酸酶适当地处理，以将任何残留的焦磷酸水解为磷酸根阴离子。
在一个实施方案中，使用包括细胞裂解，提取和色谱分离的已知提取技术，从常规生物或医学样品中存在的细胞材料中获得核酸前体。
在步骤(1)中，使含有核苷三磷酸分子的分析物在聚合酶和任选的连接酶存在下反应，以产生使用的探针双链体。在一个实施方案中,其中另外采用连接酶，此双链体将包含离散的基本上双链的第四寡核苷酸(见下文)，尽管这种第四寡核苷酸的形成对于该方法的功效并不关键。然而，所采用的核酸分析物是预期包含其相关核碱基预期被修饰或未被修饰的核苷三磷酸分子中的一个或两个的核酸分析物。术语“修饰的”是指将修饰的核碱基与其未修饰的对区别开的任何修饰，无论是化学修饰还是结构修饰。此类修饰可以包括化学修饰，例如烷基化、羟烷基化、烷氧基化、胺化、卤化、乙酰化和葡萄糖基化，尽管应当理解的是，只要该修饰不干扰在此步骤中执行的捕获，该方法通常适用于任何修饰的/未修饰的核碱基对。在一个实施方案中，所述修饰选自甲基化、羟甲基化和葡糖基化的羟甲基化。在另一个实施方案中，未修饰的核苷三磷酸分子选自选自由以下组成的组：是天然存在的dna或rna的成分的那些未修饰的核苷三磷酸分子。在又另一个相关的修饰是核碱基胞嘧啶和腺嘌呤中的一个或两个的甲基化。
在此步骤中使用的聚合酶适当地选自由以下组成的组：在反应条件下基本上既不显示核酸外切酶活性也不显示核酸内切酶活性的那些聚合酶。可以有利地使用的聚合酶的实例包括但不限于从细菌如大肠杆菌(escherichiacoli)(例如klenow片段聚合酶)、水生栖热菌(thermusaquaticus)(例如taqpol)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillusstearothermophilus)、热溶芽孢杆菌(bacilluscaldovelox)和热坚芽孢杆菌(bacilluscaldotenax)获得的原核pol1酶或酶衍生物。原则上可以在该步骤中使用任何合适的连接酶。
步骤(1)中采用的生物探针包含两个或任选地三个组分；(a)一对单链第一寡核苷酸，其标记有处于不可检测状态的不同的第一和第二特有的荧光团，和(b)第二和任选地第三未标记的单链寡核苷酸，其能够与所述第一寡核苷酸上的互补侧翼区杂交。在一个三组分实施方案中，相同的第二和第三寡核苷酸可能能够与该对中的两个第一寡核苷酸都杂交。在又一个实施方案中，其中不采用连接酶，仅第二寡核苷酸是共同的，并且采用相应的第三寡核苷酸对。在又另一个实施方案中，第二和第三寡核苷酸是离散的实体，而在又另一个实施方案中，它们是通过接头区域的方法连接的寡核苷酸区域。在后一种情况下，在一个实施方案中，接头区域连接第二和第三寡核苷酸区域的末端。所述接头区域原则上可以是任何二价基团，但方便地本身是又一个寡核苷酸区域。在一个实施方案中，此寡核苷酸接头区域不能基本上与成对的第一寡核苷酸中的任一个杂交。
选择分离的第一、第二和第三寡核苷酸，使得在步骤(1)中，第二和任选地第三寡核苷酸可以分别与相关的第一寡核苷酸上的3’侧和5’侧侧翼区域杂交，所述3’侧和5’侧侧翼区域本身并置于捕获位点的任一侧，所述捕获位点包含其核碱基与待探针检测的核苷三磷酸分子带有的核碱基互补的单核苷酸。捕获位点也是限制性核酸内切酶识别位点的一部分。这使得探针对所研究的特定核苷三磷酸具有高度选择性。
通常，在此对中的每个第一寡核苷酸长达150个核苷酸，优选10到100个核苷酸。在一个实施方案中，第二寡核苷酸比第一寡核苷酸的互补3’侧侧翼区域短至少1个核苷酸。在又一个实施方案中，在第一寡核苷酸的3’末端与在第二寡核苷酸上与其相对的核苷酸之间至少存在单核苷酸错配，以防止核苷三磷酸在此点处被聚合酶捕获。类似地，在一个实施方案中，第三寡核苷酸比第一寡核苷酸的互补5’侧侧翼区域长至少一个核苷酸，而在又一个实施方案中，在第三寡核苷酸的3’末端与在第一寡核苷酸中与其相对的核苷酸之间至少存在单核苷酸错配，以防止核苷三磷酸在此点处被聚合酶捕获。
该对中的每个第一寡核苷酸的共同特征是用一个或更多个荧光团标记，所述荧光团是其独特的和特有的。在这两个第一寡核苷酸中，这些荧光团被布置为使得当探针处于未使用状态时基本上不可检测。优选地，它们被布置成在荧光团被设计成在要被检测的那些波长处基本上不发荧光。因此，尽管荧光团可以在大部分电磁光谱中显示出广泛的低水平背景荧光，但通常会有一个或少量特定波长或波长包络，在此处荧光强度处于最大值。在一个或多个这些最大值处，荧光团被特征性地检测，基本上不应该出现荧光。在该专利的上下文中，术语“基本上不发荧光”或等同措辞是指在相关特有波长或波长包络下，附接于相关第一寡核苷酸的荧光团总数的荧光强度小于25％；优选小于10％；更优选小于1％且最优选小于0.1％的相等数量的游离荧光团的相应荧光强度。
原则上，可以使用任何方法来确保在第一寡核苷酸的未使用状态下荧光团基本上不发荧光。在一个实施方案中，这是通过将荧光团彼此紧邻布置以使它们彼此猝灭(自猝灭布置)来实现的。在又一个实施方案中，包含荧光团的区域还包括与其紧邻的分开的淬灭剂，通过这样的方法可以实现相同的结果。在该专利的上下文中，是什么构成荧光团之间或荧光团与猝灭剂之间的“紧密接近”将取决于所使用的特定荧光团和可能地第一寡核苷酸的结构特征。因此，该术语旨在应参考所需结果而不是这些项目的任何特定结构布置来解释。然而，并且仅出于提供示例的目的，指出当相邻的荧光团或相邻的荧光团以对应于典型的
关于荧光团本身，它们原则上可以选自本领域常规使用的任何一种，包括但不限于氧杂蒽部分，例如荧光素，罗丹明及其诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明b等的衍生物；香豆素部分(例如羟基-、甲基-和氨基香豆素)和诸如cy2、cy3、cy5和cy7的花菁部分。具体实例包括衍生自以下常用染料的荧光团：alexa染料、花青染料、attotec染料和罗丹明染料。实例还包括：atto633(atto-tecgmbh)、texasredtm、atto740(atto-tecgmbh)、孟加拉玫瑰红(rosebengal)、alexafluortm750c5-马来酰亚胺(invitrogen)、alexafluortm532c2-马来酰亚胺(invitrogen)和罗丹明红c2-马来酰亚胺和罗丹明绿以及诸如quasar570的亚磷酰胺染料。备选地，可以采用量子点或近红外染料，诸如li-corbiosciences提供的那些，出于解释本专利的目的，应将其视为“荧光团”。荧光团通常使用本领域已知的化学方法经由核碱基附接至第一寡核苷酸。
合适的猝灭剂包括通过
第一寡核苷酸的又一个共同特征是，它们包括至少一个核酸外切酶封闭位点。这将位于该识别位点的3’或5’侧，其取决于采用上述两种方法中的哪一种。在一个实施方案中，视情况而定，第一寡核苷酸可在两侧或邻近3’或5’端包括此类封闭位点。原则上，封闭位点可以是任何区域，凭借其化学组成，使得第一寡核苷酸在该点耐核酸外切。这样的区域可以例如包括硫代磷酸酯接头、寡核苷酸间隔子(例如，间隔子3、间隔子9，间隔子18，d间隔子等)，2’-o-甲基rna碱基，反向碱基，脱硫生物素-teg，二硫醇，己二醇和淬灭剂(例如bhq)。
在一个实施方案中，核酸外切酶封闭位点可通过使第一寡核苷酸呈圆形来实现；即闭环。在又一个实施方案中，其中单链特异性核酸外切酶在下面的步骤(4)中采用，该位点可包含在第一寡核苷酸上的双链区域。在再又一个实施方案中，也提供具有类似的核酸外切酶封闭位点的第二和/或第三寡核苷酸。
第一寡核苷酸的再又一个共同特征是它们包括限制性核酸内切酶识别位点，所述限制性核酸内切酶识别位点进一步包括上述捕获位点。该识别位点被布置在(1)核酸外切酶封闭位点的5’侧和荧光团的3’侧，或(2)核酸外切酶封闭位点的3’侧和荧光团的5’侧，其也取决于采用上述两种方法中的哪一种。
在步骤(1)的一个实施方案中，可以在相同的方法中使用一组多个生物探针，每对中的第一寡核苷酸包含不同的核苷酸捕获位点以及不同的第一和第二荧光团。在又一个实施方案中，该组可以进一步包括读者所指向的我们的欧洲专利申请17171168.2中教导的类型的其他生物探针。例如，经由举例说明，如果dna前体的甲基化状态是正在研究的，则一对可能能够捕获甲基化的或未甲基化的脱氧腺苷三磷酸，如果与核苷酸捕获位点相关的核碱基是胸腺嘧啶，而又一对甲基化的或未甲基化的脱氧胞苷三磷酸，其中捕获位点包括鸟嘌呤核碱基。在诸如这些的实施方案中，其中使用多于一种第一寡核苷酸对，优选的是，每个不同标记的第一寡核苷酸仍然包括相同的识别位点，从而需要采用最小数量的限制性核酸内切酶。在一个实施方案中，因此优选地识别位点将包含含有rna或dna的每种典型核苷酸中的至少一种的序列(视情况而定)，所述对中的一个或其他个识别位点包括修饰的核碱基。
步骤(1)适当地通过使分析物中的每种单核苷三磷酸与酶以及一种或更多种如上所述的探针在20至80℃的温度下接触来进行。
步骤(1)的产物包含一个或更多个双链体，所述双链体的组成部分分别是(i)第一寡核苷酸中的一个和(ii)包含第二寡核苷酸、源自核苷三磷酸分子的一个或其他个核苷酸分子(修饰的或未修饰的)和任选地第三寡核苷酸的组分。如上所述，在步骤(1)在连接酶存在下进行的情况下，(ii)的各种组分将一起包含离散的第四寡核苷酸，并且使用的探针将至少在识别位点附近被双链化。如果第二和第三寡核苷酸先前已通过接头区域连接在一起，则很明显这将导致第四寡核苷酸，其是闭环的且高度耐核酸外切。
同样显而易见的是，在涉及核酸分析物的二元情况下，所述核酸分析物可能包含修饰的或未修饰的核苷三磷酸分子中的一个或两个和分别带有第一和第二荧光团的一对第一寡核苷酸，可能有四个结果。这些结果的排列将包含带有个第一荧光团的第一寡核苷酸和包含第二寡核苷酸、源自分析物的修饰的核苷三磷酸分子以及任选地第三寡核苷酸的组分(“第一修饰的”)；带有第一荧光团的第一寡核苷酸和包含第二寡核苷酸、源自分析物的未修饰的核苷三磷酸分子以及任选地第三寡核苷酸的组分(“第一未修饰的”)；带有第二荧光团的第一寡核苷酸和包含第二寡核苷酸、源自分析物的修饰的核苷三磷酸分子以及任选地第三寡核苷酸的组分(“第二修饰的”)，以及带有第二荧光团的第一寡核苷酸和包含第二寡核苷酸、源自分析物的未修饰的核苷三磷酸分子以及任选地第三寡核苷酸的组分(“第二未修饰的”)。因此，在上述方法的各种实施方案中，这些双链体中的一个、两个、三个或全部四个可以存在于步骤(1)的产物中。普通技术人员还将理解，对于更复杂的分析，在存在多个探针和多种核苷三磷酸分子类型的情况下，尽管可以容易地确定随之发生的排列组，但是排列的数目将相应地增加。
在步骤(2)中，将在步骤(1)中创建的双链体在20至100℃的温度下与能够区分上述某些或所有排列的限制性核酸内切酶系统反应。如下面将解释的，这种区分是通过正确选择限制性核酸内切酶系统的组分和相应的限制性核酸内切酶识别位点的特征来实现的。在一个实施方案中，该限制性核酸内切酶系统包括至少一个切口限制性核酸内切酶，所述切口限制性核酸内切酶被设计为仅切割在其识别位点上的源自第一寡核苷酸的组分。在又一个实施方案中，限制性核酸内切酶可以是能够切割两条链的限制性核酸内切酶，并且可以使第二和/或第三寡核苷酸耐切割，例如通过在第二和第三寡核苷酸中的一个或两个中包含核酸内切封闭基团。在一个实施方案中，这些封闭基团可以选自硫代磷酸酯键和本领域常用的其他骨架修饰、寡核苷酸间隔子、磷酸基团等。在第三个实施方案中，其中不使用连接酶，限制性核酸内切酶可以是能够在捕获核苷三磷酸分子之后在保留在第二和第三寡核苷酸之间的切割位点处切割两种组分的酶。
可以与本发明的方法、探针和探针系统一起使用的合适的限制性核酸内切酶(包括切口核酸内切酶)的细节可以在http://rebase.neb.com在与其相关的数据库中找到。
在一个实施方案中，限制性核酸内切酶系统包含仅能够切割“第一修饰的”双链体的第一限制性核酸内切酶和仅能够切割“第二未修饰的”双链体的第二限制性核酸内切酶。在这种情况下，如果核苷三磷酸分子被修饰，则仅第一荧光团被释放，而如果未修饰，则仅第二荧光团被释放。在该实施方案中，如果所研究的修饰是腺嘌呤甲基化，则可以采用的一对限制性核酸内切酶包括dpni和hpy188i。
在又一个实施方案中，限制性核酸内切酶系统包含不能切割“第一修饰的”双链体的限制性核酸内切酶。在这种情况下，如果核苷三磷酸分子被修饰，则仅第二荧光团被释放，如果核苷三磷酸分子未被修饰，则第一和第二荧光团均被释放。在该实例中，如果修饰是腺嘌呤甲基化，则限制性核酸内切酶可以是例如clal或alwi。
在又一个实施方案中，限制性核酸内切酶系统包含能够切割所有双链体的第一限制性核酸内切酶和仅能够切割“第二未修饰的”双链体的第二限制性核酸内切酶。在这种情况下，第二寡核苷酸的识别位点进一步包括在通过第一限制性核酸内切酶的切割位点处的限制性核酸内切酶封闭位点，其与通过第二限制性核酸内切酶的切割位点不在同一位置。在此，如果核苷三磷酸被修饰，则仅第一荧光团被释放，如果核苷三磷酸没有被修饰，则第一和第二荧光团均被释放。如应用于腺嘌呤甲基化的该方法的一个实例是限制性核酸内切酶bfuc1和bspei与在bfuci的切割位点处包含硫代磷酸酯(phosphorothioate)封闭键的第二寡核苷酸结合使用。
在再又一个实施方案中，限制性核酸内切酶系统包含不能切割“第一修饰的”或“第二未修饰的”双链体的限制性核酸内切酶。在这种情况下，如果核苷三磷酸分子被修饰，则仅第二荧光团被释放，如果核苷三磷酸分子未被修饰，则仅第一荧光团被释放。
步骤(2)导致将至少一个双链体的第一寡核苷酸组分切割成两个单独的元件，其中一个元件带有第一或第二荧光团(视情况而定)，以及如果使用,淬灭剂。这导致三种可能的统计结果之一；(i)仅产生带有第一荧光团的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件，(ii)仅产生带有第二荧光团的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件，或(iii)获得两者的混合物。
如上所述，在步骤(2)结束时，在步骤(3)中，使包含第二寡核苷酸、源自核苷三磷酸分子的修饰或未修饰核苷酸中的一个或其他个以及任选地第三寡核苷酸(例如第四寡核苷酸)的组分与该对中的又一个对应的第一寡核苷酸分子杂交或复合，从而产生新的使用的探针双链体。然后对该双链体进行步骤(2)和(3)的重复，从而释放可检测状态的另外的荧光团，并再次再生组分/第四寡核苷酸。通过这种方法，步骤(2)和(3)迭代以产生荧光信号的进一步的增强；原则上直到基本上所有第一寡核苷酸对都已经被消耗。结果，观察者看到比其它方式所获得的荧光信号增强大得多的荧光信号增强。在一个实施方案中，其中在步骤(1)中不发生源自核苷三磷酸分子的核苷酸与第三寡核苷酸的连接(包括但不限于其中不采用第三寡核苷酸的方法的实例)，则步骤(2)可以简单地导致释放包含第二寡核苷酸和核苷酸的组分。在这种情况下，新进入的第一寡核苷酸可能已经具有了附接至其的第三寡核苷酸，或者第三寡核苷酸可能是其结构部分。
在一个实施方案中，优选的是，步骤(2)在比步骤(1)更高的温度下进行和/或步骤(3)在比步骤(2)更高的温度下进行。
在步骤(4)中，在步骤(2)和/或在步骤(3)的每次迭代的任一或两者中产生的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件被酶消化，所述酶根据正在采用两种方法中的哪一种表现出3’-5’或5’-3’核酸外切活性。因此，当发生核酸内切和随后的核酸外切时，观察者看到荧光信号的开始和快速生长。步骤(4)可以在30至100℃的温度来最有效地实现。本领域普通技术人员将理解，步骤(4)可以在迭代步骤(3)完成之后或在步骤(2)和(3)发生时并行地执行。
然后，在步骤(5)中，检测步骤(3)或步骤(2)至(4)的每次迭代中释放的荧光团，并通过推断确定与单个原始核苷三磷酸分子附接的核碱基的修饰状态；例如根据上述结果。相应的检测方法在本领域中是众所周知的；例如，该方法采用的反应介质可以用来自led、激光或高强度电磁辐射的类源的光，和使用调谐到各种第一和第二荧光团的特有的荧光波长或波长包络的光检测器或荧光分析仪收集的任何生成的荧光来查询。这又使光检测器产生特征电信号，该特征电信号可以使用已知算法在计算机中处理和分析。在一个实施方案中，分析物包括修饰的和未修饰的核苷三磷酸分子，并且该方法进一步包括步骤(6)，所述步骤(6)从步骤(5)的结果确定各自的相对比例。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的方法全部或部分地在微滴流中进行，其中至少一些微滴含有单核苷三磷酸分子；例如其排序反映逐步消化的核酸前体的原始核苷酸序列的流。例如，这种方法可以通过将这种逐步消化产生的核苷三磷酸分子一个接一个地插入到保持在不混溶载体溶剂(如烃或硅油)中的相应含水微滴的流中，以帮助维持有序化而开始。备选地，这可以通过在逐步消化区下游直接产生微滴来实现；例如，通过使反应介质从适当尺寸的微滴头出现到溶剂的流动流中。备选地，可以将来自逐步消化区的小等份反应介质定期并依次注入悬浮在溶剂中的预先存在的含水微滴流中。如果采用后一种方法，则每个微滴可能已经含有探针系统的各种组分以及实现步骤(1)-(4)所需的酶和任何其他试剂(例如缓冲液)。在再又一种方法中，可以使在前一实施方案中产生的微滴随后与这种预先存在的微滴流合并以实现类似的结果。在这些微滴方法中，步骤(5)则优选涉及将微滴递送到储存区并查询每个微滴以识别释放的荧光团，优选地在温育期之后。此后，将从每个微滴获得的结果组装成原始核酸分析物的数据特征的流。
为了避免给定微滴含有多于一个核苷三磷酸分子的风险，优选以一定速率从逐步消化区释放每个核苷三磷酸，使得每个填充的微滴平均分开1至20个，优选2个至10个空微滴。此后，使溶剂中的填充和未填充的微滴的流沿着流动路径，合适地是微流体流动路径，以一定的速率和方式流动，使得它们保持在离散状态并且没有机会彼此合并。合适地，所用微滴的有限直径小于100微米，优选小于50微米，更优选小于20微米，甚至更优选小于15微米。最优选地，它们的所有直径都在2至20微米的范围内。在一个实施方案中，通过整个系统的微滴流动速率为每秒50至3000个微滴，优选100至2000个微滴。
在本发明的第三个方面，提供多组分生物探针，其特征在于，包含：(a)由以下(i)和(ii)组成的一对单链第一寡核苷酸：(i)一对单链第一寡核苷酸，其各自包含核酸外切酶封闭位点；位于所述封闭位点5’侧的至少一个限制性核酸内切酶识别位点；位于所述识别位点内的单个核苷酸捕获位点以及分别位于所述识别位点5’侧的第一和第二荧光团，所述第一和第二荧光团被布置为基本上不可检测的，和(ii)至少一个第二和至少一个第三单链寡核苷酸，其各自与所述第一寡核苷酸分开并且能够与所述捕获位点的3’和5’侧的互补侧翼区域杂交。
在一个实施方案中，核酸外切酶封闭位点位于第一寡核苷酸的3’端附近。在又一个实施方案中，核酸外切酶封闭位点通过使该对中的每个第一寡核苷酸呈圆形来实现；即闭环。
在本发明的第四个方面，提供多组分生物探针，其特征在于，包含：(a)由以下(i)和(ii)组成的一对单链第一寡核苷酸：(i)一对单链第一寡核苷酸，其各自包含核酸外切酶封闭位点；位于所述封闭位点3’侧的至少一个限制性核酸内切酶识别位点；位于所述识别位点内的单个核苷酸捕获位点以及分别位于所述识别位点3’侧的第一和第二荧光团，所述第一和第二荧光团被布置为基本上不可检测的，和(ii)至少一个第二和至少一个第三单链寡核苷酸，其各自与所述第一寡核苷酸分开并且能够与所述捕获位点的3’和5’侧的互补侧翼区域杂交。
在一个实施方案中，核酸外切酶封闭位点位于第一寡核苷酸的5’端附近。在又一个实施方案中，核酸外切酶封闭位点通过使该对中的每个第一寡核苷酸呈圆形来实现；即闭环。
在这些第三方面和第四方面的一个实施方案中，第一寡核苷酸上的各种荧光团彼此紧密布置以便自猝灭。在又一个实施方案中，第一寡核苷酸包括淬灭剂以淬灭荧光团。合适的荧光团和猝灭剂包括但不限于上述那些。在又一个实施方案中，第二和第三寡核苷酸通过如上文说明的接头区域连接；接头区域本身优选是又一个寡核苷酸区域。
如上所说明的，出于dna或rna测序的目的，本文所述的生物探针可以组装到相应的生物探针系统中，该生物探针系统包含多重不同的第一寡核苷酸对类型，所述不同的第一寡核苷酸对类型仅在捕获位点的核碱基特征上和使用的第一和第二荧光团的荧光特征上不同。任选地，这些探针可以与我们的欧洲专利申请17171168.2中教导的类型的其他的生物探针联合采用。在一个实施方案中，可以使用一种、两种、三种、四种或更多种不同的第一寡核苷酸对类型，其仅在捕获位点的核碱基特征上和第一和第二荧光团上不同。对于天然存在的dna或rna，这些核碱基将包含a、g、c和t或u。在又一个实施方案中，使生物探针系统表现为试剂盒，所述试剂盒进一步包含连接酶、聚合酶、限制性核酸内切酶和表现出3’-5’或5’-3’核酸外切活性的酶中的至少一种，视情况而定。
现在参考以下实施例说明本发明。
实施例-探针系统的制备和使用
制备单链的第一寡核苷酸1a和1b，其分别具有以下核苷酸序列：
5’
-tttcgggtgaggtcatggtcgacaggtgggffqagatgatgatcagatgttgcccttagcx-3’
5’
-tttcgagtgaggtcatggtcgacaggtgggeeqagatgatgmatcagmatgttgcccttagcx-3’
其中a、c、g和t代表带有dna相关特有的核碱基的核苷酸；f代表使用常规胺附接化学方法用atto700染料标记的脱氧胸苷核苷酸(t)；e代表使用常规胺附接化学方法用atto594染料标记的脱氧胸苷核苷酸(t)；q代表用bhq-2淬灭剂标记的脱氧胸苷核苷酸；ma代表n6-甲基-脱氧腺嘌呤核苷酸，x代表反向3’dt核苷酸。两个第一寡核苷酸进一步包含在其自5’末端起第43个碱基处的捕获区(t核苷酸)，其选择性捕获脱氧核苷三磷酸(dntp)混合物中的脱氧腺苷三磷酸核苷酸(datps)，以及限制性核酸内切酶dpni和dpnii的识别序列，‘gatc’。
还制备了又一种单链寡核苷酸2，其包含具有与侧接两个第一寡核苷酸的捕获位点的3’区域互补的序列的寡核苷酸区域，在dpnii的切割位点的硫代磷酸酯键，以及单链寡核苷酸3，其包含具有与侧接两个具有5’磷酸基团的第一寡核苷酸的捕获位点的5’区域互补的序列的寡核苷酸区域，和3’反向dt核苷酸。他们有以下核苷酸序列：
寡核苷酸2：5’-taagggcaacatct*g-3’
寡核苷酸3：5’-ptcatcatctaaacccacctgtcgagx-3’
其中p代表5’磷酸基团，x代表反向的3’dt核苷酸和*代表硫代磷酸酯键。
然后制备包含探针系统的反应混合物。其具有对应于源自以下配方的组合物：
20ul5x缓冲液ph7.9
10ul寡核苷酸1a，250nm
10ul寡核苷酸1b，250nm
10ul寡核苷酸2，10nm
10ul寡核苷酸3，1000nm
10udpni限制性核酸内切酶(例如newenglandbiolabsinc.)
10udpnii限制性核酸内切酶(例如newenglandbiolabsinc.)
2.9ubst大片段聚合酶
2.7u铂pfx聚合酶
6.7u耐高温无机焦磷酸酶
10uldatp或n6-甲基-datp，1nm
加水至100ul
其中5x缓冲液包含以下混合物：
100ul三羟甲基氨基甲烷醋酸盐(trizmaacetate)，1m，ph8.0
50ul醋酸镁水溶液，1m
25ul醋酸钾水溶液，1m
50ultritonx-100表面活性剂(10％)
500μg牛血清白蛋白
加水至1毫升
然后通过将混合物在37℃温育10分钟来进行datp或n6-甲基-datp的捕获。然后将温度在37℃下再保持120分钟，以允许第一寡核苷酸的迭代切割。此后，将温度再升高到72℃持续15分钟，以消化带有荧光团和猝灭剂的切割的第一寡核苷酸组分。随着反应的进行，使用clariostar酶标仪(例如bmglabtech)测量反应混合物中atto700和atto594染料的荧光强度。
在存在和不存在反应的dntp组分的情况下，监测最后15分钟消化步骤中荧光强度的增长。当反应混合物中不存在dntp时，寡核苷酸1a和1b上的atto700和atto594染料不会表现出任何显著程度的荧光。当datp存在于检测混合物中时，dpnii能够迭代切割寡核苷酸1a，而dpni不能切割任一第一寡核苷酸，导致仅在核酸外切后在atto700通道中产生信号。当n6-甲基-datp存在于检测混合物中时，dpni能够迭代切割寡核苷酸1b，而dpnii不能切割任一第一寡核苷酸，导致仅在atto594通道中产生信号。
1.检测分析物中给定的核苷三磷酸分子的核碱基是否包括给定化学或结构修饰的方法，其特征在于以下步骤：(1)在聚合酶存在下，使所述分析物与包含以下组分的生物探针反应：(a)一对单链第一寡核苷酸，其各自包含核酸外切酶封闭位点；位于所述封闭位点的5’侧的至少一个限制性核酸内切酶识别位点；位于所述识别位点内的单个核苷酸捕获位点以及分别位于所述识别位点5’侧的第一和第二荧光团，所述第一和第二荧光团被布置为基本上不可检测的，和(b)至少一个第二和任选地至少一个第三单链寡核苷酸，其各自与所述第一寡核苷酸分开并且能够与所述对中的一个、另一个或两个第一寡核苷酸的捕获位点的3’和5’侧的互补侧翼区域杂交，以产生由(b1)和(b2)组成的使用的探针双链体，其中，(b1)是所述对中的一个或另一个第一寡核苷酸，(b2)是包含所述第二寡核苷酸、源自所述核苷三磷酸分子的一个或其他个修饰的或未修饰的核苷酸以及任选地所述第三寡核苷酸的组分，其中所述双链体包含四个可能的(b1)/(b2)双链体排列中的一个；(2)将步骤(1)中产生的所述双链体与限制性核酸内切酶系统反应，所述限制性核酸内切酶系统包含至少一种适合于选择性地在所述识别位点切割所述(b1)链的限制性核酸内切酶，以根据原始的核苷三磷酸分子中是否存在所述修饰而产生(i)仅带有第一荧光团的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件或(ii)仅带有第二荧光团的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件或(iii)分别带有第一和第二荧光团的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件的混合物；(3)从所述(b2)组分和所述对中的又一个第一寡核苷酸产生又一个使用的探针双链体，然后迭代步骤(2)和(3)；(4)在步骤(2)或(3)中的任何一个或两个之后，用具有3’-5’核酸外切活性的酶消化所述第一寡核苷酸元件，以产生可检测状态的荧光团，以及(5)检测在步骤(4)中释放的所述荧光团，并从观察到的荧光信号的性质推断所述原始的单核苷三磷酸分子是否被修饰。
2.检测分析物中给定的核苷三磷酸分子的核碱基是否包括给定化学或结构修饰的方法，其特征在于以下步骤：(1)在聚合酶存在下，使所述分析物与包含以下组分的生物探针反应：(a)一对单链第一寡核苷酸，其各自包含核酸外切酶封闭位点；位于所述封闭位点的3’侧的至少一个限制性核酸内切酶识别位点；位于所述识别位点内的单个核苷酸捕获位点以及分别位于所述识别位点3’侧的第一和第二荧光团，所述第一和第二荧光团被布置为基本上不可检测的，和(b)至少一个第二和任选地至少一个第三单链寡核苷酸，其各自与所述第一寡核苷酸分开并且能够与所述对中的一个、另一个或两个第一寡核苷酸的捕获位点的3’和5’侧的互补侧翼区域杂交，以产生由(b1)和(b2)组成的使用的探针双链体，其中，(b1)是所述对中的一个或另一个第一寡核苷酸，(b2)是包含所述第二寡核苷酸、源自所述核苷三磷酸分子的一个或其他个修饰的或未修饰的核苷酸以及任选地所述第三寡核苷酸的组分，其中每个双链体包含四个可能的(b1)/(b2)双链体排列中的一个；(2)将步骤(1)中产生的所述双链体与限制性核酸内切酶系统反应，所述限制性核酸内切酶系统包含至少一种适合于选择性地在所述识别位点切割所述(b1)链的限制性核酸内切酶，以根据原始的核苷三磷酸分子中是否存在所述修饰而产生(i)仅带有第一荧光团的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件或(ii)仅带有第二荧光团的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件或(iii)分别带有第一和第二荧光团的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件的混合物；(3)从所述(b2)组分和所述对中的又一个第一寡核苷酸产生又一个使用的探针双链体，然后迭代步骤(2)和(3)；(4)在步骤(2)和(3)中的任何一个或两个之后，用具有5’-3’核酸外切活性的酶消化所述第一寡核苷酸元件，以产生可检测状态的荧光团；以及(5)检测在步骤(4)中释放的所述荧光团，并从观察到的荧光信号的性质推断所述原始的单核苷三磷酸分子是否被修饰。
3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，所述限制性核酸内切酶系统包含(i)第一限制性核酸内切酶，其仅能够切割包含带有所述第一荧光团的第一寡核苷酸以及包含所述第二寡核苷酸、源自所述分析物的修饰的核苷三磷酸分子和所述第三寡核苷酸的组分的那些(b1)-(b2)双链体；和(ii)第二限制性核酸内切酶，其仅能够切割包含带有所述第二荧光团的第一寡核苷酸核以及包含所述第二寡核苷酸、源自所述分析物的未修饰的核苷三磷酸分子和所述第三寡核苷酸的组分的那些(b1)-(b2)双链体。
4.权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，所述限制性核酸内切酶系统包含不能够切割(i)和(ii)的限制性核酸内切酶，其中(i)是包含带有所述第一荧光团的第一寡核苷酸以及包含所述第二寡核苷酸、源自所述分析物的修饰的核苷三磷酸分子和所述第三寡核苷酸的组分的那些(b1)-(b2)双链体；(ii)是包含带有所述第二荧光团的第一寡核苷酸核以及包含所述第二寡核苷酸、源自所述分析物的未修饰的核苷三磷酸分子和所述第三寡核苷酸的组分的那些(b1)-(b2)双链体。
5.权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，(i)所述限制性核酸内切酶系统包含能够切割所有所述(b1)-(b2)双链体的第一限制性核酸内切酶和仅能够切割包含带有所述第二荧光团的第一寡核苷酸核以及包含所述第二寡核苷酸、源自所述分析物的未修饰的核苷三磷酸分子和所述第三寡核苷酸的组分的那些(b1)-(b2)双链体的第二限制性核酸内切酶，以及(ii)带有所述第二荧光团的第一寡核苷酸核的所述识别位点进一步包括第一限制性核酸内切酶封闭位点。
6.权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，所述限制性核酸内切酶系统包含能够切割除了包含带有所述第一荧光团的第一寡核苷酸核以及包含所述第二寡核苷酸、源自所述分析物的修饰的核苷三磷酸分子和所述第三寡核苷酸的组分的那些(b1)-(b2)双链体之外的所有(b1)-(b2)双链体的限制性核酸内切酶。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述限制性核酸内切酶系统包括至少一个切口核酸内切酶。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸外切酶封闭位点通过使每个第一寡核苷酸为闭环来实现。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)在连接酶的存在下进行，以产生包含一个所述第一寡核苷酸和互补的第四寡核苷酸的双链体，其中所述互补的第四寡核苷酸包含所述第二和第三寡核苷酸以及源自所述分析物的给定的核苷三磷酸分子，以及步骤(4)包括从所述第四寡核苷酸产生又一个使用的探针双链体。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二寡核苷酸和所述第三寡核苷酸通过接头区域连接，所述接头区域任选地本身是寡核苷酸。
11.权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述第四寡核苷酸耐受所述限制性核酸内切酶的切割。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述对中的第一寡核苷酸中的任一个或两个包括一个或更多个淬灭剂，以淬灭所述荧光团。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述分析物包含修饰的和未修饰的单核苷三磷酸分子，并且所述方法进一步包括从步骤(5)的结果确定各自的量和相对比例的附加步骤。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)在比步骤(1)更高的温度下进行和/或步骤(3)在比步骤(2)更高的温度下进行。
15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述核苷三磷酸包含在相应的微滴中，并且步骤(1)-(4)在所述微滴中进行。
16.多组分生物探针，其特征在于，包含：(a)由以下(i)和(ii)组成的一对单链第一寡核苷酸：(i)一对单链第一寡核苷酸，其各自包含核酸外切酶封闭位点；位于所述封闭位点5’侧的至少一个限制性核酸内切酶识别位点；位于所述识别位点内的单个核苷酸捕获位点以及分别位于所述识别位点5’侧的第一和第二荧光团，所述第一和第二荧光团被布置为基本上不可检测的，和(ii)至少一个第二和任选地至少一个第三单链寡核苷酸，其各自与所述第一寡核苷酸分开并且能够与所述捕获位点的3’和5’侧的互补侧翼区域杂交。
17.多组分生物探针，其特征在于，包含：(a)由以下(i)和(ii)组成的一对单链第一寡核苷酸：(i)一对单链第一寡核苷酸，其各自包含核酸外切酶封闭位点；位于所述封闭位点3’侧的至少一个限制性核酸内切酶识别位点；位于所述识别位点内的单个核苷酸捕获位点以及分别位于所述识别位点3’侧的第一和第二荧光团，所述第一和第二荧光团被布置为基本上不可检测的，和(ii)至少一个第二和任选地至少一个第三单链寡核苷酸，其各自与所述第一寡核苷酸分开并且能够与所述捕获位点的3’和5’侧的互补侧翼区域杂交。
18.权利要求16或17所述的多组分生物探针，其特征在于，所述核酸外切酶封闭位点是通过所述第一寡核苷酸中的闭环或双链区域来实现的。
19.权利要求16至18中任一项所述的多组分生物探针，其特征在于，所述第一寡核苷酸包括淬灭剂，以淬灭所述荧光团区域中的荧光团，和/或所述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸通过寡核苷酸接头区域连接。
20.多组分生物探针试剂盒，其特征在于，包括权利要求16至19中任一项所述的多重生物探针类型的集合，所述集合中的每个第一寡核苷酸针对不同特有的核碱基和不同特有的荧光团具有不同的捕获位点选择性。
21.多组分生物探针试剂盒，其特征在于，包含权利要求16、18、19或20中任一项所述的生物探针，所述生物探针包括所述第三寡核苷酸和一种或更多种聚合酶、连接酶、根据权利要求3至5中任一项所述的限制性核酸内切酶系统和具有3’-5’核酸外切活性的酶。
22.多组分生物探针试剂盒，其特征在于，包含权利要求17至20中任一项所述的生物探针，所述生物探针包括所述第三寡核苷酸和一种或更多种聚合酶、连接酶、根据权利要求3至5中任一项所述的限制性核酸内切酶系统和具有5’-3’核酸外切活性的酶。
技术总结