本发明涉及核酸检测领域。具体而言，本发明提供了用于使用可连接的嵌合dna-rna探针检测靶核酸中的靶核酸序列、并且特别是靶rna分子中的靶rna序列的方法。还提供了用于此类方法中的核酸探针。
背景技术：
靶核酸序列的检测应用于许多不同领域，包括个人化医疗、癌症诊断和治疗、传染病和生物安全性。
与靶核酸序列互补的经标记杂交探针可用于检测靶核酸序列，例如在southern或northern印迹测定中。此类探针允许简单直接地检测靶核酸序列(包括靶rna序列)，但杂交探针具有相对较高的检测下限，并且不能容易地用于区分相似的核酸序列。此外，此类探针不能容易地适用于多重或自动检测测定。
可以通过首先扩增靶序列来增强检测靶核酸分子的灵敏度。扩增技术允许在检测之前将样品中极低水平的靶序列扩增，以增加样品中靶序列的拷贝数。扩增可以使用本领域中可用的各种技术中的任一种来进行，诸如聚合酶链反应(pcr)、基于核酸特异性的扩增(nasba)、连接酶链反应(lcr)和滚环扩增(rca)。然而，这些技术主要针对扩增dna序列，并且典型地需要dna模板以便有效进行。
pcr可以用于扩增靶核酸分子，并且允许使用对靶核酸分子内侧接靶核酸序列的序列具有特异性的一对引物进行指数扩增。然而，靶rna序列不能通过pcr直接检测，并且替代地检测rna需要使用逆转录酶(rt-pcr)形成cdna中间体，随后可以对其扩增。类似地，nasba和lcr也需要初始逆转录酶步骤以便产生cdna模板用于扩增(ca2136764)。
rca利用链置换聚合酶，并且需要环状扩增模板。环状模板的扩增提供级联的rca产物，其包含与扩增模板的序列互补的序列的多个拷贝，这些拷贝可以被最终检测。环状rca模板典型地通过连接反应提供，并且可以典型地通过以下提供：使用靶特异性探针作为环化模板环化靶核酸分子，或通过使用靶核酸分子作为环化模板环化靶特异性探针。
环状rca模板可以使用对称选择探针方便地提供，该对称选择探针包含悬于较短核酸链的两个末端的较长核酸链，该较长链在其末端包含与靶核酸分子中的序列互补的序列，如us7883849中所述。杂交后，通过连接将选择子和靶核酸片段接合在一起，得到环状核酸分子。用于选择和扩增核酸的替代方法涉及基因组片段的一般环化，如drmanac等人2010.science327,78-81和us8518640中所述。用于选择靶核酸序列的基于选择探针的方法还在wo03/044229中提供。然而，尚未证明以此方式环化和扩增rna模板。
在替代技术中，代替环化靶核酸，可以将靶核酸用作用于连接一个或多个探针的模板。例如，可以使用所谓的“锁式探针”检测靶核酸序列，如例如us5871921中所述。锁式探针是线性核酸分子，其在其3'和5'末端包含与靶核酸分子互补的序列，使得在锁式探针与其靶核酸分子杂交后，使探针的末端并置以连接。对此类方法调适导致开发出以下技术：其中探针的末端结合靶核酸分子中由一个或多个碱基分隔的序列，并且其中探针各个末端之间的缺口使用核酸聚合酶(hardenbol等人2003.natbiotechnol21,673-678)、或使用连接子(或缺口)寡核苷酸(weibrecht等人natureprotocols8,355-372)填充。基于锁式探针的检测技术最近已显示可有效检测样品中的病原体。
然而，基于锁式探针的检测和扩增方法典型地利用dna作为靶标以及dna探针，因为这允许获得高水平的序列特异性，并且允许有效扩增(和检测)任何形成的连接产物。已经证明了dna探针的rna模板化连接，并且已经证明了其足够敏感以区分rna模板内的snp(nilsson等人2001.nucleicacidsresearch29,578-581)。其它研究也已经证明了使用dna锁式探针检测特定mirna(zhao等人2015.actabiochimbiophyssin47,130-136；jonstrup等人2006.rna12,1747-1752)。然而，dna连接测定典型地使用dna模板而非rna模板更好地进行(nilsson等人2000.naturebiotechnology18,791-793)，并且已经发现使用rna模板的dna连接是低效的，并且还已经发现即使在紧密相关的序列中仍具有高度可变的反应动力学。此外，大多数连接酶不耐受rna模板，并且已经证明耐受的连接酶具有较差的末端接合保真度，或者换句话说，其区分与其靶序列正确杂交的探针的能力较差。因此，典型地，本领域的方法在检测之前从靶rna分子产生cdna分子。
已经证明了核糖核苷酸探针或含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的探针的靶标依赖性连接可用于rna靶标(zhao等人，同上)。具体而言，测试了使用rna连接模板的7聚体核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸探针的各种组合的连接效率，并且显示此类探针的连接可以通过rna模板来模板化。然而，未证明扩增含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者的连接产物。此外，典型地用于rca方法中的聚合酶对包含长段核糖核苷酸的模板的加工性差。
因此，仍然需要允许有效检测更广泛范围的核酸靶标(即包括rna靶标)的技术，其不仅组合有效的连接步骤，并且允许扩增所得的连接产物，以便允许检测靶标。尽管主要是为了检测rna靶标而开发了探针和方法，但是已经发现本发明的某些新的探针和方法在dna靶标的检测中也显示出优势，并且因此它们可以更广泛地应用。
技术实现要素：
本发明的方法使用以一个或多个部分提供的探针，该探针与靶核酸分子互补并杂交，并且以靶标依赖性方式连接，其中所述探针主要由dna组成，但在相对于连接位点的特定位置包含核糖核苷酸，这些核糖核苷酸用于提高由靶核酸分子模板化的连接的效率和保真度。一旦形成连接产物，将其扩增，并且检测所得扩增产物，从而检测靶rna分子。
令人惊讶的是，在制备本发明的过程中，观察到在探针的可连接末端处或附近提供核糖核苷酸而非脱氧核糖核苷酸增强探针的连接效率，并且使用rna连接模板时特别导致连接效率增加。这在同时一起检测rna和dna靶标时检测dna靶标的背景下(即在dna靶标模板化探针的连接的情况下)也可能是有益的。已知寡核苷酸中的核糖核苷酸糖-磷酸主链由于存在抑制核糖中c2'-内构象的2'-oh而偏好特定构象。当结合靶rna分子时，连接酶对包含核糖核苷酸的探针的特异性也可能比对脱氧核糖核苷酸更高。不希望受理论束缚，据信与不包含核糖核苷酸的对应探针相比，在探针的可连接末端处或附近存在核糖核苷酸允许参与模板化连接的探针的一个或多个末端由连接酶以更高的效率和保真度识别并连接。
还观察到，当将主要由dna构成的连接探针中的连续核糖核苷酸数量保持到最低时，未显著抑制可以扩增连接产物的效率。因此，发现有可能使用包含一个或多个核糖核苷酸的探针来提高连接效率，同时允许进行所得连接产物的有效扩增。
最广泛地，本发明提供了一种检测样品中靶核酸分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：
(a)使所述样品与可连接探针接触并且使所述探针与所述靶核酸分子杂交；
(b)使用dna/rna连接酶使所述样品进行连接反应以连接已经与所述靶核酸分子杂交的任何探针；
(c)用dna聚合酶扩增来自步骤(b)的所述连接探针；以及
(d)检测来自步骤(c)的扩增产物，从而检测所述靶核酸序列；
其中每个探针以一个或多个部分提供，每个部分具有至少一个靶标特异性结合位点，所述至少一个靶标特异性结合位点与在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列的同源探针结合位点互补并且与所述靶核酸分子杂交，使得任选地在切割所述杂交探针和/或使用所述靶核酸分子作为模板延伸其3'末端的步骤之后，使用所述靶核酸分子作为连接模板使所述探针或探针部分的可连接末端并置以彼此连接，从而在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列创建连接位点；并且
其中所述探针在所述连接位点处或附近包含至少一个核糖核苷酸，任选地在所述切割和/或延伸步骤之后，并且所述连接探针主要由dna构成并且包含不超过4个连续核糖核苷酸。
本发明的检测方法因此可以用于检测靶dna分子中的靶dna序列和/或靶rna分子中的靶rna序列。特别优选的是，所述靶核酸序列是rna序列并且所述靶核酸分子是rna分子。
在一个实施方式中，所述方法包括使用至少一个针对rna靶序列的探针和至少一个针对dna靶序列的探针来检测rna和dna靶序列两者。因此，靶rna和dna分子可以在同一样品中。在这种情况下，在使用rna连接酶的情况下，dna靶向探针在与并置以连接的可连接末端杂交时在连接位点处或附近还含有至少一个核糖核苷酸是有益的。
本发明因此提供了一种方法，其允许有效连接包含dna和rna核苷酸两者的探针，并且随后直接从由靶核酸分子模板化的连接反应中扩增连接产物，即无需首先提供与靶分子互补的cdna分子。这因此提供了一种相对于本领域先前已知的方法简化的检测方法。此外，在检测rna的背景下，因为省去了制备单独的cdna分子的需求，所以可以更容易地与检测其它核酸序列(诸如靶dna序列)一起进行靶rna分子中靶rna序列的检测。这可以例如允许在同一样品中同时检测靶rna和dna序列。
还提供了一种用于这种方法的探针。更特别地，可环化探针是特别感兴趣的，并且在此方面，本发明因此提供了一种嵌合dna-rna锁式探针，其能够结合并检测靶核酸分子中的靶核酸序列，其中：
(i)所述探针包括一个或多个部分，每个部分具有至少一个靶标特异性结合位点，所述至少一个靶标特异性结合位点与在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列的同源探针结合位点互补并且与所述靶核酸分子杂交，使得任选地在切割所述杂交探针和/或使用所述靶核酸分子作为模板延伸其3'末端的步骤之后，使用所述靶核酸分子作为连接模板使所述探针或探针部分的可连接末端并置以彼此连接，以在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列创建一个或多个连接位点，其中所述连接位点处的连接环化所述探针；
(ii)所述探针在连接位点处或附近包含至少一个核糖核苷酸；并且
(iii)所述探针在连接以形成环时主要由dna构成并且包含不超过4个连续核糖核苷酸。
因此，在一个特定实施方式中，本发明提供了一种检测样品中靶核酸分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与锁式探针接触并且使所述探针与所述靶核酸分子杂交；
b)使用dna/rna连接酶使所述样品进行连接反应以连接并且从而环化已经与所述靶核酸分子杂交的任何探针；
c)通过用dna聚合酶进行滚环扩增来扩增来自步骤(b)的连接的环化探针；以及
d)检测来自步骤(c)的扩增产物，从而检测所述靶核酸序列；
其中每个锁式探针以一个或多个部分提供，每个部分具有至少一个靶标特异性结合位点，所述至少一个靶标特异性结合位点与在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列的同源探针结合位点互补并且与所述靶核酸分子杂交，使得任选地在切割所述杂交探针和/或使用所述靶核酸分子作为模板延伸其3'末端的步骤之后，使用所述靶核酸分子作为连接模板使所述探针或探针部分的可连接末端并置以彼此连接，从而在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列创建连接位点；并且
其中所述探针在连接位点处或附近包含至少一个核糖核苷酸，任选地在所述切割和/或延伸步骤之后，并且所述连接的环化探针主要由dna构成并且包含不超过4个连续核糖核苷酸。
本发明的探针可以用于检测靶dna分子中的靶dna序列和/或靶rna分子中的靶rna序列，如下文所论述。因此，在一个优选的实施方式中，所述探针能够结合并检测靶rna分子中的靶rna序列。
由于所述探针可以以一个或多个部分提供，因此可以存在超过一个连接结合点。换句话说，一个或多个探针部分可以各自包含或产生(即通过切割或延伸)可连接5'和3'末端，并且所述探针整体可以包含或产生一个或多个可连接5'末端和一个或多个可连接3'末端。
在某些实施方式中，探针可以包含两个或更多个部分并且可以创建两个或更多个连接结合点。连接结合点因此可以在两个不同探针部分之间提供(或更特别地，在两个不同探针部分的可连接末端之间，或由两个不同探针部分的末端产生)，或在单个部分探针的两个末端之间提供或由单个部分探针的末端产生。
在连接后，提供在连接位点处或附近包含至少一个核糖核苷酸的探针。连接位点是探针的5'可连接末端处的末端5'磷酸基团与探针的3'可连接末端处的末端3'羟基基团连接的位点，并且连接可以在各自可连接末端直接并置并且与靶核酸分子中其各自互补碱基对正确杂交时发生。因此，连接位点一旦形成就是探针或探针部分的3'和5'可连接末端处的核苷酸之间的结合点，并且其位置由这些核苷酸之间形成的磷酸二酯键限定。因此，根据本发明的方法和探针，参与连接反应的至少一个核苷酸(即提供末端5'磷酸基团或3'羟基基团的核苷酸)或连接位点附近的核苷酸是核糖核苷酸。优选地，连接位点处的可连接3'末端处或附近的至少一个核苷酸是核糖核苷酸。换句话说，在一个优选的实施方式中，当与靶核酸分子杂交使得3'和5'末端并置以连接时，所述探针在可连接的3'末端处或附近包含至少一个核糖核苷酸。
因此将看出，连接后，探针在连接位点处或附近(或更特别地，一个或多个连接位点处或附近)包含至少一个核糖核苷酸，其存在在连接反应期间增强连接的特异性和效率。根据本发明，在存在两个或更多个连接结合点的情况下，在这些连接结合点中的一个或多个处或附近可以存在至少一个核糖核苷酸。不是必需，但优选的是，在每个连接结合点处或附近存在至少一个核糖核苷酸。本发明的方法因此可以认为提供了使用模板靶核酸分子(例如靶rna分子)增强主要dna探针的连接的手段。换句话说，本发明的方法可以用于改善样品中靶核酸分子的检测。显著地，通过提供包含不超过四个连续核糖核苷酸的连接产物，所述方法还允许进行连接产物的扩增而无显著阻碍。
在连接位点处或附近的任何核苷酸可以是核糖核苷酸而不是脱氧核糖核苷酸。术语“附近”在此上下文中是指连接位点5个核苷酸内的位置，即连接位点的5个核苷酸3'和连接位点的5个核苷酸5'。因此，连接位点的5个核苷酸内的任一个核糖核苷酸都可以是核糖核苷酸。核糖核苷酸可以优选地在连接位点的4个核苷酸内，或更优选地在连接位点的3个核苷酸内的位置处提供。在又一个实施方式中，核糖核苷酸可以在连接位点的2个核苷酸内。因此，在3'或5'可连接末端的末端核苷酸和/或倒数第二个核苷酸可以是核糖核苷酸。在某些实施方式中，在3'或5'可连接末端(优选3'可连接末端)处的倒数第二个核苷酸可以是核糖核苷酸。
在一个优选的实施方式中，核糖核苷酸可以在连接位点的3'或5'可连接末端处。在本文中，术语‘在……处’具体指寡核苷酸末端处的末端核苷酸，即提供用于连接的羟基或磷酸基团的核苷酸。因此，在一个实施方式中，提及探针在连接位点处包含核糖核苷酸是指3'可连接末端的末端3'核苷酸或5'可连接末端的末端5'核苷酸是核糖核苷酸。优选地，连接位点处的3'可连接末端是核糖核苷酸。
连接位点处或附近的超过一个核苷酸可以是核糖核苷酸。因此，在某些实施方式中，在连接位点处或附近的超过一个的核糖核苷酸(即在连接位点的5个核苷酸内的10个核苷酸中的任何一个)可以是组合核糖核苷酸，条件是连接探针包含不超过4个其它地方论述的连续核糖核苷酸。
在一个优选的实施方式中，探针在探针或其部分的可连接末端处包含至少一个核糖核苷酸。优选地，探针在连接位点处的3'可连接末端处包含至少一个核糖核苷酸。换句话说，在探针或其部分的可连接3'末端处的核苷酸优选是核糖核苷酸而不是脱氧核糖核苷酸。
在某些实施方式中，探针或探针部分在连接位点处的5'可连接末端处或附近不包含核糖核苷酸，并且特别是在连接位点处的5'可连接末端处不包含核糖核苷酸。在某些实施方式中，在5'可连接末端由探针或探针部分的5'末端提供的情况下(即在5'可连接末端不是通过切割杂交探针而产生的情况下)，探针或探针部分的5'末端核苷酸优选不是核糖核苷酸。换句话说，在本发明的一个优选实施方式中，探针或其部分的可连接5'末端处的核苷酸是脱氧核糖核苷酸。在此类实施方式中，来自探针或其部分的可连接3'末端处的核苷酸(它是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的3'羟基基团连接至5'脱氧核糖核苷酸。
如上文所简述，最终形成连接位点的上文所述的可连接末端需要直接并置并且与靶核酸分子中其各自的互补碱基对杂交，以便进行连接。然而，根据探针和/或其部分的设计，可连接末端可以以多种方式并置以连接。
在一个具体的实施方式中，探针或其部分的3'末端是在连接位点处的可连接3'末端。因此，在这种实施方式中，可连接3'末端提供在探针的3'末端处(或者可替代地由其表达)，或换句话说，探针与靶核酸分子杂交，使得探针的3'末端可以连接至连接位点处的可连接5'末端。
因此，在一个优选的实施方式中，探针在探针或其部分的3'末端处或附近(但优选地在3'末端处)包含至少一个核糖核苷酸。因此，探针不仅可以在连接位点处的可连接3'末端处或附近包含至少一个核糖核苷酸，如上文所述，而且探针或其部分的3'末端本身可以是如本文所述的可连接3'末端。因此，在这种实施方式中，如本发明方法的步骤(a)中提供的探针或探针部分可以在其3'末端处或附近包含至少一个核糖核苷酸，所述末端与靶核酸序列杂交并且是用于步骤(b)的连接反应的可连接3'末端。换句话说，在此类实施方式中，探针或其部分的3'末端处的核苷酸参与连接反应，并且在检测方法的过程期间连接至连接位点处的可连接5'末端。
在本发明的另一个实施方式中，探针的5'末端是在连接位点处的可连接5'末端。因此，可连接5'末端可以提供在探针或其部分的5'末端处，或者换句话说，探针可以与靶核酸分子杂交，使得探针或其部分的5'末端可以连接至连接位点处的可连接3'末端。
因此，在一个具体实施方式中，两个可连接末端可以提供在探针或探针部分的末端处，或者换句话说，探针可以与靶核酸分子杂交，使得使用靶核酸分子作为连接模板，使探针或探针部分的可连接末端直接并置以彼此连接，而无需对探针的任何进一步修饰或加工(例如切割或延伸)。换句话说，探针或其每个部分可以在其一个或多个末端包含至少一个靶标特异性结合位点，使得探针(或其部分)的每个末端可以与靶核酸分子中的直接相邻的同源探针结合位点杂交，使得提供可连接的末端以连接。换句话说，在某些实施方式中，步骤(b)可以由连接步骤组成，而无需任何其它步骤来提供并置以连接的探针或探针部分的5'和3'末端。
然而，不需要探针在其各自的末端包含靶标特异性结合位点，所述末端与靶核酸分子中彼此直接相邻的同源序列杂交，以便使如上文所述的可连接末端并置以连接，并且任选地探针的一个或两个可连接末端可以仅在连接发生之前的一个或多个处理步骤中产生。
在本发明的一个优选实施方式中，当探针与靶核酸分子杂交(即通过切割杂交探针)时，可以通过切割创建探针或其部分的5'可连接末端。
因此，探针可以包含提供5'可连接末端的探针或探针部分(或外部)的附加序列5'，使得探针或探针部分的5'可连接末端仅可以在所述附加序列已通过切割(切割)后创建。换句话说，探针或探针部分可以包含5'附加序列。因此，探针或探针部分可以包含位于探针或探针部分的5'末端内部的第一靶标特异性靶结合位点，使得探针或探针部分与靶核酸分子杂交并且在适当时候在连接位点(即靶标特异性结合位点)提供可连接5'末端的部分在其5'末端包含不与靶核酸分子杂交的附加序列。以此方式，在已经通过切割移除位于探针或探针部分的5'可连接末端的5'的任何附加序列，可以进行探针连接。
不与靶核酸分子杂交的第一靶标特异性结合位点的此附加序列5'因此形成5'活瓣(flap)，所述5'活瓣可以通过切割去除，从而创建探针或探针部分的5'可连接末端。
应理解，在多部分探针(即包括两个或更多个部分的探针)中，可以形成超过一个5'活瓣。例如，在两部分探针(例如包含主链寡核苷酸和缺口寡核苷酸的锁式探针，所述缺口寡核苷酸与主链寡核苷酸的两个杂交末端之间的靶标杂交，如下文进一步所述)的情况下，主链寡核苷酸的5'末端可以形成5'活瓣。在另一个实施方式中，缺口寡核苷酸的5'末端可以形成5'活瓣，并且在又一个实施方式中，主链和缺口寡核苷酸的5'末端均可以形成5'活瓣。另外，多部分锁式探针可以包含超过一个缺口寡核苷酸。因此，两个或更多个缺口寡核苷酸可以各自形成5'活瓣。
因此，在步骤(a)之后，所述方法可以包括切割已经与靶核酸分子杂交的任何探针的步骤。此步骤移除在探针或探针部分与靶核酸分子杂交时形成的(或任何)5'活瓣。
切割杂交探针以移除5'活瓣的步骤可以使用酶来进行。能够进行移除5'活瓣的反应的任何酶可以用于此步骤中，即能够切割、降解或消化不与靶核酸分子杂交的5'单链序列的任何酶，但是典型地这将是具有5'核酸酶和/或结构特异性切割活性的酶。
以此方式形成的5'活瓣可以由结构特异性切割酶识别，例如能够识别单链5'突出端与dna双链体之间的结合点并且切割单链突出端的酶。应理解，作为结构特异性切割酶的底物的支链三链结构可以由一个探针部分的5'末端和另一个探针部分的3'末端在两者已经与靶核酸分子杂交时形成，以及由一个探针的5'和3'末端形成。适用于这种切割的酶包括flap核酸内切酶(fens)，其是一类具有核酸内切酶活性并且能够催化单链和双链dna结合点处的磷酸二酯键的水解切割的酶。因此，在一个优选的实施方式中，第一靶标特异性结合位点的附加序列5'由结构特异性切割酶，例如flap核酸内切酶切割。在优选的实施方式中，所述酶可以是来自激烈火球菌(pfu)、闪烁古生球菌(afu)、詹氏甲烷球菌(mja)或嗜热自养甲烷杆菌(mth)的天然或重组古细菌fen1酶，例如如ma等人2000.jbc275,24693-24700中所述。
在其它实施方式中，能够识别并降解具有游离5'末端的单链寡核苷酸的酶可以用于从如上文所述的结构切割附加序列(5'活瓣)。因此，具有5'核酸酶活性的酶可以用于切割5'附加序列。这种5'核酸酶活性可以是5'核酸外切酶和/或5'核酸内切酶活性。5'核酸酶能够识别单链寡核苷酸的游离5'末端并降解所述单链寡核苷酸。5'核酸外切酶通过将来自其5'末端的寡核苷酸降解为组成单核苷酸来降解具有游离5'末端的单链寡核苷酸。5'核酸内切酶活性可以在一个或多个核苷酸内部切割5'活瓣序列。此外，5'核酸酶活性可以通过酶在识别出游离5'末端之后使单链寡核苷酸跨越双链体区域，并且将单链区切割成较大的组成核苷酸(例如二核苷酸或三核苷酸)，或切割整个5'单链区域来发生，例如针对taqdna聚合酶和其5'核酸酶如lyamichev等人1999.pnas96,6143-6148中所述。具有5'核酸酶活性的优选酶包括核酸外切酶viii，或来自水生栖热菌(thermusaquaticus)(taq)、嗜热栖热菌(thermusthermophilus)或黄色栖热菌(thermusflavus)的天然或重组dna聚合酶，或来自其中的核酸酶结构域。
在如上文所述探针或探针部分在其5'末端包含附加序列的某些实施方式中，附加序列内的一个或多个核苷酸可以与靶核酸分子中的同源核苷酸互补，但可以不与探针或探针部分(可以是不同的探针部分，如上文所提及)的3'可连接末端同时与靶核酸分子杂交。特别地，以此方式，所述附加序列的3'末端处(即5'活瓣的3'末端处)的一个或多个核苷酸可以与靶核酸分子中的同源核苷酸互补。因为它们不能与靶核酸分子杂交，并且被探针或探针部分的3'可连接末端防止如此，所以可以视为附加序列形成置换活瓣，并且所述附加序列内与靶核酸分子中的同源核苷酸互补的核苷酸可以被认为是置换核苷酸或置换碱基。
因此，在一个优选的实施方式中，附加序列的3'末端处(即在最接近第一靶结合位点的附加序列的末端处)的一个或多个核苷酸与靶核酸分子中的同源核苷酸互补，其中所述核苷酸不能与探针的3'可连接末端或另一个探针部分的3'可连接末端同时与靶核酸分子杂交。换句话说，附加序列的3'末端处的一个或多个核苷酸可以通过3'可连接末端防止与靶核酸分子结合，或者可以认为是从靶核酸分子置换而来。因此，这些核苷酸可以称为置换核苷酸。
在可能发生探针连接之前，需要通过切割移除任何这种附加序列。在其(或一个)5'末端具有这种附加序列的探针(即其中第一个靶标特异性结合位点位于探针或探针部分的5'末端内部的探针)因此可以被认为需要在连接之前被活化(即通过切割)。
令人惊讶的是，对于dna和rna靶核酸分子，已经发现在探针的5'附加序列中，特别是在所述5'附加序列的3'末端处存在核糖核苷酸(即附加序列的最3'核苷酸)增强附加序列的移除(即切割)效率。下文更详细描述的所谓的侵入性切割反应中特别指出此效果。上文所述的附加序列因此可以在某些实施方式中包含一个或多个核糖核苷酸。在本发明的某些实施方式中，5'附加序列的3'末端处的一个或多个核苷酸可以是核糖核苷酸。更特别地，如上文所述的5'附加序列的3'末端处的与靶核酸分子中的同源核苷酸互补的一个或多个核苷酸(即如上文所述的置换核苷酸)可以是核糖核苷酸。在一个具体实施方式中，附加序列可以完全由核糖核苷酸组成。
探针的5'附加序列的增强切割与增强的连接效率是分开的，该增强的连接效率是由于具有位于嵌合dna-rna探针中的连接位点处或附近的核糖核苷酸而产生的。因此，切割之后在连接位点处或附近不包含核糖核苷酸的探针中也可以看到上文所述的效果。
在另一个方面，本发明因此提供了一种检测样品中靶核酸分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：
(a)使所述样品与可连接探针接触并且使所述探针与所述靶核酸分子杂交；
(b)使用dna/rna连接酶使所述样品进行连接反应以连接已经与所述靶核酸分子杂交的任何探针；
(c)用dna聚合酶扩增来自步骤(b)的所述连接探针；以及
(d)检测来自步骤(c)的扩增产物，从而检测所述靶核酸序列；
其中每个探针以一个或多个部分提供，每个部分具有至少一个靶标特异性结合位点，所述至少一个靶标特异性结合位点与在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列的同源探针结合位点互补并且与所述靶核酸分子杂交，其中所述探针的一个靶标特异性结合位点或探针部分的至少一个靶标特异性结合位点位于所述探针或探针部分的5'末端内部，使得在所述探针或探针部分与所述靶核酸分子杂交后，所述探针或探针部分包含至所述靶标特异性结合位点的附加序列5'，所述附加序列5'不与所述靶核酸分子杂交并且形成5'活瓣，其中所述5'附加序列的3'末端处或附近的一个或多个核苷酸是核糖核苷酸，并且其中在切割所述杂交探针以移除所述5'活瓣的步骤之后，并且任选地在使用所述靶核酸分子作为模板延伸其3'末端的步骤之后，使用所述靶核酸分子作为连接模板，使所述探针或探针部分的可连接末端并置以彼此连接，从而在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列处创建连接位点。
特别地，5'附加序列的3'末端处的核苷酸可以是核糖核苷酸。任选地，在5'附加序列的3'末端附近的一个或多个核苷酸也可以是核糖核苷酸。
靶核酸序列可以是靶dna序列或靶rna序列，并且靶分子可以是靶dna分子或靶rna分子。如上文所论述，本发明的此方面的此方法还可以用于检测超过一个靶序列(包括在超过一个靶分子中)，并且可以包括检测rna和dna靶分子中的rna和dna靶序列(例如在同一样品中)。
在另一个方面，本发明因此提供了一种用于这种方法的探针。本发明的此方面提供了一种嵌合dna-rna探针，其能够结合并检测靶核酸分子中的靶核酸序列，其中：
(i)所述探针包括一个或多个部分，每个部分具有至少一个靶标特异性结合位点，所述至少一个靶标特异性结合位点与在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列的同源探针结合位点互补并且与所述靶核酸分子杂交，其中所述探针的第一靶标特异性结合位点或探针部分的靶标特异性结合位点位于所述探针或探针部分的5'末端内部，并且所述探针或探针部分包含至所述靶标特异性结合位点的附加序列5'，使得当所述探针或探针部分与所述靶核酸分子杂交时，所述附加序列形成5'活瓣，所述5'活瓣不与所述靶核酸分子杂交，并且可以通过切割移除以产生可以连接至所述探针或探针部分的3'末端的可连接5'末端，其中所述附加序列含有一个或多个核糖核苷酸(优选在其3'末端)，使得在切割杂交探针或探针部分的步骤之后并且任选地在使用所述靶核酸分子作为模板延伸其3'末端的步骤之后，使用所述靶核酸分子作为连接模板，使所述探针或探针部分的可连接末端并置以彼此连接，从而在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列处创建一个或多个连接位点。
在一个优选的实施方式中，形成5'活瓣的任何附加序列的3'末端处的核苷酸与靶核酸分子中与探针的3'末端处的核苷酸相同的同源核苷酸互补。因此，任何附加序列的3'末端处(即在最接近第一靶结合位点的附加序列的末端处)的一个或多个核苷酸可以与靶核酸分子中的同源核苷酸互补，其中所述核苷酸不能与探针的3'可连接末端或另一个探针部分的3'可连接末端同时与靶核酸分子杂交。
这种探针可以任选地是单个部分或两个(或更多个)部分的锁式探针，或包含两个或更多个如本文中其它地方所定义的部分的探针，除了它在连接位点处或附近不包含核糖核苷酸。
具有在连接之前需要通过切割移除的5'附加序列的探针是本领域熟知的，例如呈用于侵入测定中的侵入探针的形式。本领域的侵入测定典型地包括使用具有靶标特异性结合位点的第一探针和第二探针，其中第一探针包含位于探针的5'末端内部的第一靶结合位点。在这种测定中，第一探针和第二探针典型地被设计成互补的并且能够与靶核酸分子中的同源结合位点杂交，使得第一探针与靶核酸分子的5'部分杂交，并且第二探针直接与第一探针并置地与靶核酸分子的3'部分杂交，并且防止第一探针的附加序列的3'末端处的核苷酸与靶核酸分子杂交。换句话说，在侵入测定中，5'附加序列的3'末端处的核苷酸是如上文所述的置换核苷酸。由于第二探针防止第一探针的附加序列的3'末端与靶核酸分子杂交，并且随后切割了5'附加序列，因此此类方法也称为侵入性切割反应。
因此，本发明的探针可以是侵入探针。此类探针特别可用于检测单核苷酸多态性。本发明的检测方法因此可以用于检测靶核酸序列中的单核苷酸多态性或实际上任何变体碱基。用于这种方法的探针可以被设计成使得探针的3'可连接末端与靶分子中感兴趣的核苷酸(变体核苷酸)互补并且能够与其杂交，并且探针的5'末端处或另一个不同探针部分的5'末端处的5'附加序列的3'末端处的核苷酸与相同的所述核苷酸互补，但被3'可连接末端防止与其杂交(即它是如上文所述的置换核苷酸)。切割探针以移除附加序列提供5'可连接末端，如果3'可连接末端与靶核酸分子正确杂交(即与其互补)，则5'可连接末端可以连接至探针或探针部分的3'可连接末端。根据此原理设计的探针提供在感兴趣位置处的不同变体之间的高度区分，因为只有3'可连接末端与感兴趣位置处的核苷酸互补的探针才能参与连接反应。在一个实施方式中，探针以单个部分提供，并且3'和5'可连接末端由同一探针提供。
最近，已经证明了侵入探针的替代设计提供与上文概述的设计相当的结果(krzywkowski等人2017.nucleicacidsresearch45,e161)。尽管此设计在利用锁式探针(如下文将详细描述的“入侵锁式”(ilock)探针)的入侵测定中具体公开，但此类探针的某些特征通常可以适用于侵入探针。
在此替代设计中，探针(其在ilock探针的上下文中以具有一个部分的探针提供)被设计成使得锁式探针中3'靶标特异性结合位点(如本文所述的第二靶标特异性结合位点)的3'核苷酸与感兴趣核苷酸的靶核酸分子3'中的核苷酸(即与紧接变体核苷酸3'的核苷酸)互补并且能够与其杂交，并且锁式探针中的5'靶标特异性结合位点(如本文所述的第一靶标特异性结合位点)的5'核苷酸与靶核酸分子中感兴趣的核苷酸(即变体核苷酸)互补，并且能够与其杂交。此类探针包含至第一靶标特异性结合位点的附加序列5'，使得第一靶标特异性结合位点位于探针的5'末端内部。附加序列的最3'末端核苷酸与感兴趣核苷酸的靶核酸分子3'中的核苷酸(即紧邻感兴趣核苷酸/变体核苷酸的3')互补，但是被探针的3'可连接末端(即第二靶标特异性结合位点)防止与靶核酸分子杂交，并且因此是置换核苷酸。如上文，可以提供类似的探针设计，其中5'靶标特异性结合位点和3'靶标特异性结合位点由不同的探针部分提供。
因此，更通常地，探针可以被设计成使得探针或探针部分的3'可连接末端与感兴趣核苷酸(变体核苷酸)的靶分子3'中的核苷酸互补并且能够与其杂交，并且探针的5'附加序列的3'末端处或另一个不同探针部分的5'末端处的核苷酸与感兴趣核苷酸(紧邻变体核苷酸的3'的核苷酸)的核苷酸3'互补，但被探针或探针部分的3'可连接末端防止与其杂交。切割以移除附加序列提供5'可连接末端，如果5'可连接末端与靶核酸分子正确杂交(即与其互补)，则5'可连接末端可以连接至探针或探针部分的3'可连接末端。根据此原理设计的探针提供在感兴趣位置处的不同变体之间的高度区分，因为只有5'可连接末端与感兴趣位置处的核苷酸互补的探针才能参与连接反应。如上文所述，在一个实施方式中，探针以单个部分提供，并且3'和5'可连接末端由同一探针提供。
因此，在某些实施方式中，本发明的方法可以用于检测靶核酸分子中的变体碱基。特别地，根据上文提及的“侵入”设计中的任一种的探针可以特别用于检测靶核酸分子中的变体碱基。
在创建5'活瓣的此类侵入探针中，在一些实施方式中优选的是，如上文所提及，附加序列(创建5'活瓣)的3'末端处或附近的一个或多个核苷酸是核糖核苷酸。更特别地，附加序列的最3'核苷酸或至少最3'核苷酸(或换句话说，切除的5'活瓣的3'末端核苷酸)是核糖核苷酸。
侵入型探针可以以锁式探针提供，所述锁式探针可以由一个或多个部分构成，如下文进一步描述。因此，锁式探针可以是与靶核酸分子杂交以形成“侵入”结构的单个部分挂锁，或者它可以包含两个或更多个杂交以形成一个或多个具有用于切割的5'活瓣的“侵入”结构的部分。
在一个具体的代表性实施方式中，用于这种方法的探针是以单一可环化寡核苷酸提供的锁式探针，其包含位于所述探针的5'末端内部的第一靶标特异性结合位点和位于所述探针的3'末端处的第二靶标特异性结合位点，使得在所述探针与所述靶核酸分子杂交后，所述探针包含不与所述靶核酸分子杂交的所述第一靶结合位点的附加序列5'，其中所述探针的3'末端处的核苷酸是核糖核苷酸并且其中所述探针的3'末端和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与同一核苷酸互补，其中当所述探针的3'末端处的核苷酸和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与变体碱基互补时，所述附加序列的3'末端处的核苷酸不能与所述探针的3'末端同时与所述靶核酸分子杂交并且通过切割移除所述附加序列从而产生所述探针的5'可连接末端，并且其中当所述附加序列的3'末端处的核苷酸和所述探针的3'末端处的核苷酸不与所述变体碱基互补时，所述附加序列的3'末端处的核苷酸通过切割移除并且所述探针的3'末端处的核苷酸不与所述靶核酸分子杂交，从而防止连接。
在另一个具体的代表性实施方式中，所述探针是单一可环化寡核苷酸，其包含位于所述探针的5'末端内部的第一靶标特异性结合位点和位于所述探针的3'末端处的第二靶标特异性结合位点，使得在所述探针与所述靶核酸分子杂交后，所述探针包含不与所述靶核酸分子杂交的所述第一靶结合位点的附加序列5'，其中所述探针的3'末端处的核苷酸是核糖核苷酸，并且其中所述探针的3'末端处和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与同一核苷酸互补，其中所述探针的3'末端处的核苷酸和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与所述变体碱基的所述位置3'处的核苷酸互补并且其中所述附加序列的3'末端处的核苷酸不能与所述探针的3'末端同时与所述靶核酸分子杂交，其中当所述第一靶标特异性结合位点的5'末端处的核苷酸与所述变体碱基互补时，通过切割移除所述附加序列从而产生所述探针的5'可连接末端，并且其中当所述第一靶标特异性结合位点的所述5'末端处的核苷酸不与所述变体碱基互补时，也通过切割移除所述核苷酸，从而在所述5'可连接末端与3'可连接末端之间产生缺口并且防止连接。
在其它实施方式中，此类侵入锁式探针可以类似地以两个或更多个部分提供，所述锁式探针例如包含主链寡核苷酸和一个或多个缺口寡核苷酸，如下文进一步描述。
在某些实施方式中，可以将探针设计为结合靶核酸分子内的两个或更多个非连续序列。换句话说，探针或两个探针部分可以与在探针或探针部分的相应靶结合位点之间具有缺口的靶核酸分子杂交。当探针或探针部分的末端已杂交以留下缺口时，可以使用靶核酸分子作为延伸模板，通过在连接至5'末端之前将探针的杂交3'末端延伸来填充此缺口。在探针的3'末端已经延伸到与5'可连接末端相邻后，可以通过连接反应将两个末端连接起来。以此方式，探针的可连接3'末端可以通过延伸产生。
由于将靶核酸序列的补体掺入到连接探针中，这种延伸缺口-填充实施方式可以特别用于检测高度可变的靶核酸序列。因此，在扩增之后，检测扩增的连接探针(例如通过测序)允许确定靶核酸序列的序列。在其它实施方式中，这种通过延伸的缺口填充可以与通过切割5'活瓣产生可连接5'末端的特征相组合。因此，在侵入型探针的背景下，缺口填充延伸也可以用于产生或提供3'可连接末端。
上文所述的‘延伸缺口填充’实施方式需要将核苷酸掺入延伸产物中，并且因此在这类实施方式中，反应混合物中需要核苷三磷酸的混合物以进行延伸。在某些实施方式中，提供的一个或多个核苷三磷酸(一个、两个、三个或全部四个核苷三磷酸)(natp、ngtp、nctp、dttp/rutp)可以是核糖核苷三磷酸。这可以允许在延伸探针的3'末端的过程中将至少一个核糖核苷酸掺入3'可连接末端。因此，在一个实施方式中，提供的核苷三磷酸分子中的三个可以是脱氧核糖核苷三磷酸，并且第四核苷三磷酸分子可以是核糖核苷三磷酸。优选地，基于靶核酸分子序列的了解，以核糖核苷三磷酸提供的一种或多种核苷三磷酸可以选择成使得在聚合后所得延伸产物的3'末端处或附近的核苷酸(例如连接位点处的3'可连接末端的3'末端核苷酸)是核糖核苷酸。通过代表性实例，如果已知在探针的两个部分之间的缺口的5'末端处的核苷酸是“g”，则可以使用包含rctp的核苷三磷酸的混合物，从而在延伸探针的3'可连接末端处提供rctp核苷酸。
在使探针或其部分延伸以提供3'可连接末端的一些实施方式中，提供并且与靶核酸分子杂交的探针(或部分)可以完全由dna构成，并且可以如上文所述通过延伸引入核糖核苷酸。因此，在这种实施方式中，可以提供dna探针并使其与靶分子杂交，并且与靶核酸分子杂交的可连接探针可以通过延伸步骤变成嵌合dna-rna探针。换句话说，在本发明的方法中，具有并置以连接(即准备连接)的可连接5'末端和3'末端的与靶分子杂交的可连接探针可以是嵌合dna-rna探针。
在通过延伸反应将核糖核苷酸引入可连接探针的实施方式中，可以在可连接3'末端处或附近引入核糖核苷酸，例如延伸序列的末端和/或倒数第二个3'核苷酸可以是核糖核苷酸，和/或延伸反应可以引入5个或更少个核苷酸，或不超过4个核苷酸。
可以使用rna作为延伸模板的任何便利的聚合酶，优选非置换聚合酶都可以用于进行上文所述的‘缺口填充’延伸，包括rna聚合酶和dna聚合酶。因此，rna依赖性rna聚合酶(rdrp)，和/或rna依赖性dna聚合酶(rddp)(例如逆转录酶)可以用于上文所述的‘缺口填充’实施方式中。
在一个优选的实施方式中，聚合酶可以能够使用rna模板将dna和rna残基两者掺入延伸产物中，例如包含e895a或e895g取代的突变的人线粒体dna聚合酶γ，已经令人惊讶地发现所述聚合酶将rntp和dntp核苷三磷酸两者掺入延伸产物中(kasiviswanathan等人2011.jbc286,31490-31500)。
用于本文公开的检测方法中的探针可以以一个或多个部分提供，其每个部分包含至少一个靶标特异性结合位点，所述至少一个靶标特异性结合位点与靶核酸分子中的靶核酸序列处或相邻于靶核酸序列的同源探针结合位点互补。因此，探针(或其每个部分)能够与靶核酸分子杂交。探针或探针部分以如下这种方式与靶核酸分子杂交：使用靶核酸分子作为连接模板，使其末端并置以彼此连接，任选地在切割杂交探针和/或使用靶核酸分子作为模板延伸其3'末端的步骤之后。因此，本发明的检测方法的步骤(b)的连接反应包括在相邻探针或与靶核酸分子杂交的探针的一部分的相应可连接3'和5'末端之间形成至少一个磷酸二酯键。
在某些实施方式中，探针可以以两个或更多个部分提供，每个所述部分具有与靶核酸分子中的同源探针结合位点互补的至少一个靶标特异性结合位点。因此，在一个实施方式中，探针可以以两个部分提供，其每个部分包含靶结合位点，并且步骤(b)中的连接包括将探针的一个部分的3'可连接末端连接至另一个部分的5'可连接末端。如上文更详细地描述，探针的各个可连接末端可以通过在连接之前切割和/或延伸来产生。
在本发明的其它实施方式中，探针可以以创建两个或更多个连接结合点的两个或更多个部分提供，例如两个、三个、四个、五个或更多个部分。探针的每个部分可以提供(即形成或包含)3'和/或5'可连接末端，所述3'和/或5'可连接末端可以并置以连接并且在如上文所概述的本发明的检测方法的步骤(b)中连接。在某些实施方式中，步骤(b)因此可以包括两个或更多个单独的连接反应，即由探针的两个或更多个部分提供的相邻可连接末端之间的连接反应。
因此，探针可以以超过两个部分(例如以三个部分)提供，每个所述部分具有与靶核酸分子中的同源探针结合位点互补的至少一个靶标特异性结合位点。在这种实施方式中，步骤(b)中的连接包括探针的第一部分的5'可连接末端与探针的第二部分的3'可连接末端的连接，以及探针的第二部分的5'可连接末端与探针的第三部分的3'可连接末端的连接。
在具体实施方式中，以超过两个部分提供的探针的一个或多个部分可以是用于通过连接测序的寡核苷酸。在本发明的上下文中，通过连接测序允许检测具有在至少一个末端由已知序列侧接的未知序列(例如靶核酸序列)的靶核酸分子，从而允许确定所述未知序列。如本文所述的探针的一个或多个部分可以具有与靶核酸分子中的同源探针特异性结合位点互补的靶标特异性结合位点，并且可以进一步在其5'和/或3'末端包含与未知序列中的特定核苷酸互补的核苷酸。探针的部分可以仅在与未知序列中的核苷酸正确杂交时连接，并且因此后续对扩增的连接产物的检测可以允许确定靶核酸序列。在一个具体实施方式中，在多部分锁式探针的背景下，一个或多个缺口寡核苷酸(如下文进一步论述)可以是用于通过连接测序的寡核苷酸。
在某些实施方式中，并且如上文所简单论述，用于本发明的检测方法中的探针可以是包含一个或多个部分的锁式探针，所述一个或多个部分任选地在切割步骤之后被连接在一起以形成圆。在一个典型的实施方式中，锁式探针可以包含线性单链寡核苷酸(主链寡核苷酸)，其包含两个靶标特异性结合位点，所述两个靶标特异性结合位点与靶核酸分子中的同源探针结合位点互补，所述靶核酸分子通过不与靶核酸互补的序列(主链或接头)连接，并且因此(任选地在如上文所论述的切割和/或延伸之后)为连接反应提供3'和5'可连接末端。锁式探针的5'和3'末端因此可以参与使用靶核酸分子作为连接模板的一个或多个连接反应，从而形成环状核酸分子。
在某些实施方式中，锁式探针可以以单一可环化寡核苷酸提供，所述单一可环化寡核苷酸包含位于所述探针的5'末端处或内部的第一靶标特异性结合位点和在所述探针的3'末端处的第二靶标特异性结合位点，其中第一靶标特异性结合位点和第二靶标特异性结合位点分别形成或构成所述探针的5'可连接末端和3'可连接末端。
在此类实施方式中，连接可以是直接的，即锁式探针的5'和3'末端可以与彼此直接相邻的靶核酸分子杂交，使得锁式探针的3'末端连接至锁式探针的5'可连接末端，从而形成环状连接产物。可替代地，在此类实施方式中，锁式探针的5'和3'末端可以与靶核酸分子杂交，在其靶标特异性结合位点之间具有缺口，并且探针的3'末端可以如本文其它地方所述延伸，以提供探针的3'可连接末端为连接至锁式探针的5'可连接末端。
以单一可环化寡核苷酸提供的锁式探针可以任选地包含其5'靶结合位点的附加序列5'，所述附加序列可以被切割以在连接位点处提供5'可连接末端。因此，在一个具体的实施方式中，所述探针可以是单一可环化寡核苷酸，其包含位于所述探针的5'末端内部的第一靶标特异性靶结合位点和位于所述探针的3'末端处的第二靶标特异性结合位点，使得在所述探针与所述靶核酸分子杂交后，所述探针包含不与所述靶核酸分子杂交的所述第一靶结合位点的附加序列5'，其中所述附加序列的3'末端处的核苷酸是核糖核苷酸，所述核糖核苷酸与所述靶核酸分子中的同源核苷酸互补但不能与所述探针的3'可连接末端同时与所述靶核酸分子杂交，其中通过切割移除所述附加序列从而创建所述探针的5'可连接末端。
锁式探针可以可替代地以两个或更多个部分提供，即提供为两个或更多个寡核苷酸，所述寡核苷酸经连接以形成环状寡核苷酸。第一寡核苷酸可以包含在其5'末端处或内部的第一靶标特异性结合位点和在其3'末端处的第二靶标特异性结合位点，并且可以与靶核酸分子杂交，在其靶标特异性结合位点之间具有缺口。然而，并非延伸锁式探针的3'末端以提供用于连接的3'可连接末端，可以提供第二寡核苷酸(和任选的第三、第四等寡核苷酸)，其包含与靶核酸分子中位于第一靶标特异性结合位点和第二靶标特异性结合位点的各自同源探针结合位点之间的同源探针结合位点互补的一个或多个靶标特异性结合位点。在这种实施方式中，锁式探针的环化包括将第一寡核苷酸的5'和3'可连接末端连接至这些寡核苷酸的3'和5'可连接末端(例如分别连接至第二寡核苷酸的3'和5'可连接末端)。在此类实施方式中，第二寡核苷酸和后续的寡核苷酸可以被认为是缺口寡核苷酸。以两个或更多个部分提供的锁式探针因此可以被认为包含主链寡核苷酸(即包含第一靶标特异性结合位点和第二靶标特异性结合位点的寡核苷酸)和一个或多个缺口寡核苷酸。
一个或多个缺口寡核苷酸可以用于通过连接测序，如上文所述。
在某些实施方式中，锁式探针(或更特别地，锁式探针的主链寡核苷酸)本身可以以两个或更多个部分，优选以两个部分提供，所述部分可以在环化锁式探针的过程中在不同于在与靶核酸分子杂交的探针或探针部分的部分之间形成的连接位点的位置处连接。换句话说，锁式探针的主链寡核苷酸可以以两个或更多个部分提供，所述部分可以在不与靶核酸互补的序列(即如上文所述的主链或接头)内的位置处连接。其中主链寡核苷酸以两个部分提供的主链寡核苷酸的锁式探针的实例示于图17中。
以两个或更多个部分提供的主链寡核苷酸的这种连接可以通过连接模板来模板化，所述连接模板能够与主链寡核苷酸的两个或更多个部分的每一个杂交，从而使各自的5'和3'末端并置以连接。连接模板因此包含与主链寡核苷酸的两个或更多个部分的每一个的末端处的序列互补的区域。
连接模板可以是单独的寡核苷酸，例如与探针一起或分别添加到样品中，或与探针预先杂交的寡核苷酸，或者可以是另一个靶核酸分子，或同一靶核酸分子的另一个部分(即位于同一靶核酸分子内的不同位置处的另一个单独靶序列)。因此，连接模板可以是合成或天然寡核苷酸，并且可以是rna分子或dna分子。
主链寡核苷酸的部分的连接可以是直接的或间接的，如本文其它地方所定义，或者可能需要缺口填充延伸或与在主链寡核苷酸的两个部分的末端之间的连接模板杂交的其它寡核苷酸(即类似于缺口寡核苷酸)。此外，连接可能需要切割5'附加序列，任选地其中附加序列的3'末端处的核苷酸是核糖核苷酸，和/或其中在连接位点处或附近提供核糖核苷酸，如本文其它地方所述。可以看出，这种环化方法(其中主链寡核苷酸以2个或更多个部分提供)可以方便地用于在不同于作为模板的(主要)靶分子上的所述(或一个)连接位点的位点处将核糖核苷酸引入主链寡核苷酸(例如通过使用rntp延伸)。在主链寡核苷酸中的一个或多个不同位点处存在一个或多个此类核糖核苷酸可能有益于连接的(环化的)锁式探针，因为这起作用以加速rca反应，如下文所论述。
在步骤(b)期间发生超过一个连接的情况下(即在形成两个或更多个连接位点的情况下)，任何连接位点均可以包含如上文更详细论述的至少一个核糖核苷酸(即探针可以在任何连接位点处或附近包含核糖核苷酸)。因此，在存在两个或更多个连接位点的情况下，一个或多个所述连接位点可以包含如本文所定义的至少一个核糖核苷酸。在本发明的一个具体实施方式中，探针可以在每个连接位点处或附近包含核糖核苷酸。因此，在一个优选方面，以两个或更多个部分提供的探针的任何一个或所有部分可以在连接位点处的可连接3'末端处或附近包含至少一个核糖核苷酸，并且在一个具体实施方式中，探针的每个部分可以在连接位点处的其可连接3'末端处或附近包含至少一个核糖核苷酸。更优选地，探针的每个部分可以在其3'末端处或附近包含至少一个核糖核苷酸。然而，应注意，在探针以两个或更多个部分提供的情况下，所述两个或更多个部分中的仅一个可以在其可连接3'末端处或附近或在其3'末端处包含至少一个核糖核苷酸是足够的。
在探针以如上文所述的两个或更多个部分提供的情况下，探针的任何或所有部分的5'可连接末端可以通过切割来创建，如本文其它地方所述。特别地，以两个或更多个部分提供的探针的任何或所有部分的靶标特异性结合位点可以位于探针部分的5'末端内部(即可以包含不与靶核酸分子杂交的靶结合位点的附加序列5')，所述附加序列可以在连接之前通过切割移除。类似地，探针的任何两个或更多个部分可以与靶核酸分子中的非连续序列杂交，并且它们之间的缺口视需要通过延伸任何或所有探针的3'末端来填充，如上文所论述。
探针中所含的核糖核苷酸数量并不关键，只要探针满足连接探针包含不超过4个连续核糖核苷酸的要求即可。更特别地，连接探针可以包含不超过3个连续核糖核苷酸，并且在一个优选的实施方式中，不超过2个连续核糖核苷酸(例如1个或2个核糖核苷酸)。因为探针可以包含超过一个连接位点，并且核糖核苷酸可以存在于每个或多个连接位点处或附近，所以应理解，核糖核苷酸可以存在于连接探针中的多个(即两个或更多个)位点处，但在每个位点处，存在不超过4个(或3个或2个)连续核糖核苷酸。换句话说，在每个连接位点处可以存在1个核糖核苷酸或不超过4个(或3个或2个)连续核糖核苷酸，实际上，在上文阐述的范围内，在整个探针的其它位点处(即不仅在连接位点处)包括核糖核苷酸没有限制。令人惊讶的是，已经发现在环状连接探针中存在核糖核苷酸允许滚环扩增更快地进行。用于本发明方法的探针因此可以任选地在一个或多个位点处(包括在不同于连接位点处或附近的一个或多个位置处)包含一个或多个(和至多4个连续)核糖核苷酸。
如上文所述，探针或探针部分可以具有第一靶结合位点的附加序列5'，并且此附加序列形成可以移除的5'活瓣。如上文所述，附加序列(5'活瓣序列)可以包含一个或多个可以连续的核糖核苷酸，并且数量不受限制；这些核糖核苷酸可以通过切割移除，使得当连接探针时，探针中剩余不超过4个(或不超过3个或2个)连续核糖核苷酸。
在探针是锁式探针的一些实施方式中，主链寡核苷酸可以完全由dna构成，并且核糖核苷酸可以包含在一个或多个缺口寡核苷酸中(更具体地，在其3'可连接末端处或附近)，和/或它们可以通过延伸引入，如上文所论述。在其它实施方式中，在上文的范围内，主链寡核苷酸可以含有一个或多个核糖核苷酸，例如单个核糖核苷酸可散布在各处。在另一个实施方式中，主链寡核苷酸可以在3'可连接末端处或附近包含至少一个核糖核苷酸。在这种实施方式中，一个或多个缺口寡核苷酸还可以在其3'可连接末端处或附近含有至少一个核糖核苷酸。可替代地，可以仅在主链寡核苷酸中提供核糖核苷酸。可以使用这些特征的任何组合。
本发明因此可以可替代地视为提供一种检测与可连接嵌合dna-rna探针杂交的靶核酸分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：
i)连接与靶核酸分子杂交的嵌合dna-rna探针；
ii)用dna聚合酶扩增来自步骤(i)的所述连接探针；并且
iii)检测来自步骤(ii)的扩增产物，从而检测所述靶核酸序列；
其中所述可连接嵌合dna-rna探针以一个或多个部分提供，每个部分具有至少一个靶标特异性结合位点，所述至少一个靶标特异性结合位点与在所述靶核酸序列处或相邻于靶核酸序列的同源探针结合位点互补并且与所述靶核酸分子杂交，使得使用所述靶核酸分子作为连接模板使所述探针或探针部分的可连接末端并置以彼此连接，从而在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列创建连接位点；并且
其中所述可连接嵌合dna-rna探针在所述连接位点处或附近包含至少一个核糖核苷酸，并且所述连接探针主要由dna构成并且包含不超过4个连续核糖核苷酸。
显然的是，根据这种方法，例如在切割和/或延伸步骤之后，可能已经产生彼此并置以连接的探针或探针部分的可连接末端，如上文更详细描述。
靶核酸分子可以是检测、分析或扩增所需的任何序列。因此，它可以是dna或rna或其修饰变体。因此，核酸可以由核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸以及能够参与watson-crick型或类似碱基对相互作用的合成核苷酸构成。因此，核酸可以是或可以包含例如亚硫酸氢盐转化的dna、lna、pna或任何其它含有非核苷酸主链的衍生物。
靶核酸分子因此可以是编码或非编码dna，例如基因组dna或其子部分，或者可以衍生自基因组dna，例如其拷贝或扩增子，或者它可以是cdna或其子部分，或者其扩增子或拷贝等。
如上文所提及，靶核酸分子可以是靶rna分子。靶核酸分子可以，例如它可以是rna池中的rna分子或其它核酸分子或核苷酸序列，例如人类或来自任何来源，来自转录组，或任何其它核酸(例如细胞器核酸，即线粒体或质体核酸)，天然存在或合成的核酸。靶rna分子因此可以是或可以源自编码(即前mrna或mrna)或非编码rna序列(诸如trna、rrna、snorna、mirna、sirna、snrna、exrna、pirna和长ncrna)。靶rna分子典型地可以是期望在样品中检测的rna分子，从其是测定的靶标，即分析物的意义上而言。在一个优选的实施方式中，靶核酸分子是微rna(mirna)。在另一个优选的实施方式中，靶rna分子是16srna，优选地其中16srna来自样品中的微生物(例如病原微生物)并且可从其中鉴定。可替代地，靶rna分子可以是以rna为其遗传物质的病毒的基因组rna，例如ssrna或dsrna。值得注意的，此类病毒包括埃博拉病毒、hiv、sars、流感、丙型肝炎、西尼罗河热、脊髓灰质炎和麻疹。因此，靶rna分子可以是来自病毒基因组的正义rna、反义rna或双链rna，或来自逆转录病毒rna基因组的正义rna。
本发明的方法对于检测短靶核酸分子，并且特别是短靶rna分子具有特别的优势，它们通常难以通过本领域已知的常规技术扩增和表征。因此，在本发明的具体实施方式中，靶核酸分子的长度可以小于或至多100个核苷酸，或更优选地长度小于或至多90、80、70、60、50、40、30或25个核苷酸。特别优选的此类短核酸分子是mirna分子，其长度典型地是19-25个核苷酸。wo2015/071445中示出了具有一对包含6个核苷酸的靶标特异性结合位点的锁式探针，所述靶标特异性结合位点各自可以结合靶核酸分子并且以靶标依赖性方式连接。因此，较短的靶标(例如rna)分子，例如包含至少18、17、16、15、14、13或12个核苷酸的靶标分子也可以在本发明的方法中检测到。靶核酸分子可以具有在上述任意整数之间的范围内的多个核苷酸。
靶核酸分子可以存在于样品内。样品可以是含有任何数量核酸的任何样品，其来自任何来源或属于任何来源，在所述样品中需要检测靶核酸分子中的靶核酸序列。样品因此可以是任何临床或非临床样品，并且可以是其中可能存在靶核酸分子的任何生物、临床或环境样品。
样品可以是任何含有靶核酸分子的样品，并且包括天然和合成样品，即天然存在的材料或已制备的制剂。天然存在的样品可以在经受本发明的方法之前经处理或加工。包括所有生物和临床样品，例如生物体的任何细胞或组织样品，或由其衍生的任何体液或制剂，以及诸如细胞培养物、细胞制剂、细胞裂解物等的样品。还包括环境样品，例如土壤和水样品或食物样品。样品可以是新鲜制备的，或者它们可以以任何方便方式进行预处理，例如存储。
代表性样品因此包括可以含有靶核酸分子的任何材料，包括例如食品和相关产品、临床和环境样品。样品可以是生物样品，其可以含有任何病毒或细胞材料，包括所有原核或真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。这种生物材料因此可以包括所有类型的哺乳动物和非哺乳动物动物细胞、植物细胞、包括蓝绿色藻类的藻类、真菌、细菌、原生动物等，或病毒。代表性样品因此包括全血和血液源性产物，诸如血浆、血清和血沉棕黄层、血细胞、尿液、粪便、脑脊液或任何其它体液(例如呼吸道分泌物、唾液、乳汁等)、组织、活组织检查、细胞培养物、细胞悬浮液、条件培养基或细胞培养物成分的其它样品等。可以以任何方便或期望的方式预处理样品，以准备用于本发明的方法和用途，例如通过细胞裂解或纯化、核酸或rna的分离等。
在一个具体的实施方式中，样品包含已经从临床样品或临床样品的培养物中分离的微生物细胞或病毒。在这种样品中，靶核酸分子可以是存在于微生物细胞中的核苷酸序列，例如可以从微生物细胞或病毒中在任何水平下，例如在类型、群、纲、属、物种或品系水平下表征、区分、或鉴别的核苷酸序列。
本文所述的探针，以及实际上探针的一个或多个部分可以包含一个或多个其它序列，所述其它序列可以用于将序列引入连接产物中，例如标签或检测序列，例如条形码或可鉴别基序，或检测探针或引物的结合位点。这种其它序列可以例如在探针或探针部分的3'或5'末端(优选位于探针或探针部分的可连接末端的相反端)处发现，或者可以在探针或探针部分末端的中间发现，例如在不与靶核酸分子杂交的可环化主链寡核苷酸的一部分中发现。诸如条形码的标签或探针/引物结合位点可以以不同的需求/目的来设计，例如，为了引入通用或常见序列，以使得能够一起处理多重环境中的不同连接探针，例如以引入通用或常见扩增引物的结合位点。这将使得能够一起扩增不同的连接探针，例如通过pcr或rca呈文库扩增。可替代地或另外，标签/条形码序列可以用于“标记”不同的扩增的连接探针，使得它们可以容易地彼此区分(即“靶标”标签或标记物)，或者标记不同的样品等，使得它们可以在常见/通用扩增步骤之前汇集(即“样品”标签或标记物)。因此，在多重环境中，可以为不同的探针(即用于不同靶核酸分子的探针)提供不同的标签序列(例如不同的标记物或检测序列)和/或可以为它们提供相同的一个或多个标签序列，例如以用于引入常见或通用序列。此类方法可以优选与通过杂交测序、通过连接测序或其它下一代测序化学方法结合使用，例如用于样品中多个靶核酸的多重检测中。
术语“检测”在本文中广泛地使用以包括确定靶核酸分子中靶核酸序列的存在的任何手段。应理解的是，在本发明的方法中，靶核酸通过检测样品中扩增的连接探针(即存在还是不存在)或扩增的连接探针的任何测量形式来检测。因此，步骤(c)的扩增产物可以作为靶核酸序列的“报告子”来检测。因此，在步骤(d)中检测扩增产物可以包括以任何方式确定、测量、评估或测定扩增的连接探针的存在或不存在或数量或位置。样品中扩增的连接探针的存在(即确认其存在或量或连接)指示或鉴定靶核酸序列的存在，因为探针的成功连接(允许扩增发生)取决于靶核酸分子，并且更特别地其中靶核酸分子的存在。因此，检测扩增的连接探针允许确定靶核酸序列的存在。
包括定量和定性测定、测量或评估，包括半定量的。此类测定、测量或评估可以是相对的(例如在检测样品中的两个或更多个不同的靶核酸分子时)，或绝对的。因此，术语“定量”在定量样品中的一个或多个靶核酸分子的上下文中使用时可以指绝对或相对定量。绝对定量可以通过包括已知的一种或多种浓度的一个或多个对照rna分子和/或以已知对照rna分子参照靶核酸分子的检测水平(例如通过生成标准曲线)来实现。可替代地，相对定量可以通过比较两个或更多个不同靶核酸分子之间的检测水平或量以提供两个或更多个不同rna分子中的每一个的相对定量(即相对于彼此)来完成。
可以相对于探针及其靶核酸分子的序列来选择探针的序列。因此，尽管相对于它们所结合的靶核酸分子选择靶互补区，但是探针其余部分的序列并不是关键的。然而，应该选择序列以避免分子内杂交的发生。在选择或鉴定序列后，可以使用任何方便的方法合成探针。
如本文所用的术语“杂交”或“杂交化”是指在充分互补以经由watson-crick碱基配对形成双链体的核苷酸序列之间形成双链体。当两个核苷酸序列共有碱基对组织同源性时，这些分子是“互补的”。因此，探针区域中的互补区是指该区域中能够形成双链体(或换句话说，结合其同源互补序列)的一部分。这些术语还用于指代类似于watson-crick碱基配对的碱基对相互作用，包括hoogsteen碱基配对，其是很少观察到的碱基配对变异，它也允许第三链缠绕以watson-crick模式组装的双螺旋以形成三链体。
可以选择添加到样品中的探针量以在反应混合物中提供足够低的探针浓度从而最小化非靶标特异性相互作用，即确保探针不会随机结合样品中的非靶核酸分子到任何较大或明显的程度。然而，一般，将以超过靶分子的量使用探针。在代表性实施方式中，与样品组合后，反应混合物中每个探针的浓度在约1fm至1μm，诸如10，约1pm至约1nm的范围内，包括约1pm至约100nm，例如1、2、5、10、20、50nm。
可以将多个不同的探针添加到样品中以用于多重测定(例如，在样品中存在多个不同的靶核酸分子的情况下)，以便并行检测多个靶核酸分子。多重测定可能涉及样品中数十个、数百个、数千个或甚至数万个核酸分子的检测。因此，多重测定可以包含至少2个不同的探针，即能够与不同的第一rca产物(直接或间接地)杂交并且因此例如检测不同分析物的探针。例如，多重测定可以利用至少20、3、4、5、10、20、30、40或50个探针，例如100、200、500、1000、10000或更多个探针。此外，本发明的检测方法(即用于检测靶核酸分子的检测方法)可以与用于检测样品中其它核酸分子的更广泛的方法组合使用。在一个其中靶核酸分子是靶rna分子的具体实施方式中，这可以允许与用于检测样品中的其它(例如非rna)核酸分子的更广泛方法组合检测靶rna分子。
在将含有靶核酸分子的样品和一个或多个探针组合后，可以将反应混合物温育一段足以使一个或多个探针结合样品中其靶核酸分子的时段。如上文所述，在探针已经结合靶核酸分子之后，连接探针(任选地在切割和/或延伸杂交探针的步骤之后)以产生可以随后被扩增的连接产物，并且检测扩增产物从而检测靶核酸序列。
在一些代表性实施方式中，例如在原位测定或其中固定靶核酸分子的其它测定中，可以在添加探针与连接和/或扩增连接产物之间包括洗涤步骤。换句话说，可以将靶核酸分子捕获或固定在固体支持物或底物上，将其洗涤以移除未结合或非特异性结合的探针。在一些实施方式中，可以在连接探针与扩增连接产物之间包括洗涤步骤，以移除未连接探针。在其它代表性实施方式中，在进行连接之前可以包括洗涤步骤。
在探针是多部分挂锁的情况下，可以使主链寡核苷酸与样品接触并使其杂交，并且然后可以添加一个或多个缺口寡核苷酸(如果使用)并使其杂交。可替代地，可以一起添加多部分探针的所有部分。
连接包括在与靶核酸序列杂交并且并置以连接的两个相邻碱基中，探针3'处的3'oh基团与探针5'末端处的5'磷酸基团之间形成磷酸二酯键。因此，根据探针的设计，可以在核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸上提供3'oh基团和/或5'磷酸基团。因此，可以选择能够以靶标特异性方式催化磷酸二酯键形成的连接酶。
连接酶可以是dna连接酶(即特征在于其能够催化在与靶核酸分子杂交的两个相邻的脱氧核糖核苷酸之间形成磷酸二酯键的连接酶)或rna连接酶(即特征在于其能够催化与靶核酸分子杂交的两个相邻核糖核苷酸之间形成磷酸二酯键的连接酶)。如实施例所证明，现已显示dna和rna连接酶两者催化以有效和靶标依赖性方式在与靶标核酸分子杂交的相邻的3'核糖核苷酸与5'脱氧核糖核苷酸之间，以及相邻的3'核糖核苷酸与5'核糖核苷酸之间形成磷酸二酯键。因此，dna和rna连接酶均可以用于本发明的方法中。因此，提及dna/rna连接酶包括dna和rna连接酶，其能够连接杂交的3'和5'核苷酸以形成如本文所述的在连接位点处或附近包含核糖核苷酸的连接产物。
特别可用于本发明的检测方法中的示例性连接酶包括小球藻病毒dna连接酶(pbcv-1dna连接酶i)、t4dna连接酶、t4rna连接酶1(t4rnl1)、t4rna连接酶2(t4rnl2)和drarn1连接酶。迄今为止，t4dna连接酶和pbcv-1连接酶的rna模板化末端接合保真度仅针对dna探针表征。令人惊讶的是，与现有技术的仅dna探针相比，当将如本文定义的探针用于靶核酸序列的检测时，观察到连接的效率和保真度提高。
可以将合适的连接酶和必要和/或期望的任何试剂与反应混合物组合，并且保持在足以发生杂交的寡核苷酸的连接的条件下。连接反应条件是本领域技术人员熟知的。在连接期间，反应混合物在某些实施方式中可以维持在约4℃至约105℃、约4至约80℃，诸如约10至约70℃、约15至约60℃，典型地诸如约20℃至约37℃范围内的温度下持续在约5秒至约16小时，诸如约1分钟至约1小时范围内的时间段。在又其它实施方式中，反应混合物可以维持在约35℃至约45℃，诸如约37℃至约42℃范围内，例如在或约38℃、39℃、40℃或41℃下的温度下持续在约5秒至约16小时，诸如约1分钟至约1小时，包括约2分钟至约8小时范围内的时间段。在一个代表性实施方式中，连接反应混合物包括50mmtrisph7.5、10mmmgcl2、10mmdtt、1mmatp、25mg/mlbsa、0.25单位/mlrna酶抑制剂和0.125单位/ml的t4dna连接酶。在又一个代表性实施方式中，采用2.125mm镁离子、0.2单位/mlrna酶抑制剂；0.125单位/mldna连接酶。
显然，连接条件可以取决于本发明方法中使用的连接酶。因此，上文所述的连接条件仅是代表性实例，并且参数可以根据熟知的方案改变。然而，应进一步理解，改变一个参数(例如温度)可能需要修改其它条件以确保测定的其它步骤不受抑制或破坏，例如探针与靶核酸分子的结合。rca测定方法的这种操作在本领域是常规的。
在形成连接探针后，将其扩增以增加样品中连接产物的拷贝数，这可以增加本发明的检测方法的灵敏度。在某些实施方式中，连接探针的一部分或部分被扩增。连接探针(或其部分)可以使用本领域已知的任何方便的方法，诸如pcr或其变型、sda、had、lamp或smap来扩增。
在一个优选的实施方式中，通过连接环化探针。优选地，在此类实施方式中，可以通过滚环扩增(rca)来扩增探针。使用环状模板进行扩增的滚环扩增提供包含多个串联重复序列的串联rca产物，每个重复序列具有与环状模板寡核苷酸互补的序列(即环化的连接产物)。rca可以例如通过使样品与单独的引物接触来进行，所述引物与所得环互补并且能够与其杂交，并且可以延伸所述引物的3'末端以提供串联的rca产物。可替代地，靶核酸分子可以包含或提供可以充当rca扩增的引物的3'末端。
使用dna聚合酶，即能够从dntp合成dna寡核苷酸的聚合酶进行连接探针的扩增。如本文所用的术语“dna聚合酶”包括能够掺入dntp的任何酶，并且因此包括具有dna和rna聚合酶活性的酶。特别地，dna聚合酶可以是其主要活性或功能是合成dna，但是也能够掺入rna核苷酸的酶。可以选择能够使用嵌合dna-rna寡核苷酸作为扩增模板的dna聚合酶，因为连接探针包含至少一个核糖核苷酸。用于步骤(c)的代表性聚合酶包括ventdna聚合酶和bstdna聚合酶。
令人惊讶的是，还发现phi29dna聚合酶能够使用含有核糖核苷酸的嵌合模板寡核苷酸合成dna寡核苷酸，其包括将脱氧核糖核苷酸掺入与靶核酸分子中的核糖核苷酸互补的合成产物中。换句话说，phi29能够充当逆转录酶，并且掺入对应于与模板中的核糖核苷酸互补的rna碱基的dna核苷酸(dntp)。已经证明了使用phi29dna聚合酶扩增包含至多四个连续核糖核苷酸的连接探针。在上文定义的本发明的各种方法的方法优选实施方式中，dna聚合酶是phi29dna聚合酶。然而，phi29的这种令人惊讶的新观察到的接受含rna的底物的能力拓宽了phi29介导的扩增，并且特别是rca的应用范围，并且开辟了除上文所述的本发明的检测方法以外的酶的新用途。例如，基于phi29的rca不仅可应用于核酸检测，而且可应用于下一代测序技术的寡核苷酸合成和文库制备。
在一个方面，本发明因此提供了phi29dna聚合酶作为逆转录酶的用途。
可替代地看，此方面还提供了一种合成dna分子的方法，所述方法包括使包含rna和dna碱基的模板核酸分子与phi29dna聚合酶接触，并且产生其的dna反向补体。
尽管已经报道了通过引入特定的氨基酸取代可以将phi29dna聚合酶转化为具有rna依赖性的dna聚合酶活性，但尚未证明野生型phi29dna聚合酶或任何其它尚未为了增加逆转录酶活性而进行修饰的phi29序列变体可能具有以此方式起作用的能力。
特别地，本发明因此提供phi29dna聚合酶作为逆转录酶的用途，其中未对phi29dna聚合酶的序列进行修饰以增加逆转录酶的活性。
此外，本发明还提供了一种合成dna分子的方法，所述方法包括使包含rna和dna碱基的模板核酸分子与phi29dna聚合酶接触，并且产生其的dna反向补体，其中尚未对phi29dna聚合酶的序列进行修饰以增加逆转录酶活性。
特别地，本发明提供了一种通过滚环扩增合成dna分子的方法，所述方法包括使包含至少一个核糖核苷酸和不超过四个连续核糖核苷酸的环状模板核酸分子与phi29dna聚合酶接触，并且产生dna分子，所述dna分子包含所述模板核酸分子的反向互补序列的多个串联重复序列，其中未修饰所述phi29dna聚合酶的序列以提高rt活性。
提及未修饰phi29dna聚合酶的序列以增加逆转录酶活性，意指尚未为了引入(即赋予)或增加逆转录酶活性的目的将序列修饰引入phi29氨基酸序列，所述逆转录酶活性是酶对包含一个或多个核糖核苷酸的模板起作用并且将与模板中核糖核苷酸互补的脱氧核苷酸掺入合成产物中的活性。因此，该序列没有被修饰以赋予或增加phi29dna聚合酶的逆转录酶活性。这并不排除与野生型或天然序列相比，phi29酶的氨基酸序列可以具有其它序列修饰，但是没有旨在地或有意地引入修饰以赋予或增加活性。更特别地，相对于野生型或天然phi29酶可能存在的任何序列修饰都不会赋予或增加rt活性。
通过代表性实例，用于将phi29dna聚合酶转化为具有rna依赖性dna聚合酶活性的结构引导方法概述于us2017/0159033中，其提出了许多氨基酸取代以提供具有诸如以下的特性：与对应的亲本聚合酶相比，模板聚合酶稳定性或加工性增加、核酸外切酶活性降低和/或模板特异性改变。可以被取代的示例性氨基酸包括可能与rna/dna异源双链体发生冲突的那些氨基酸，或可能导致聚合酶与模板2'oh部分之间的空间冲突的那些氨基酸，并且提出了许多示例性取代。其它氨基酸取代可以是降低或消除phi29dna聚合酶的核酸外切酶活性的那些，增加活性位点中同源碱基亲和力的取代，抑制引物链与核酸外切酶结构域结合的取代，提高读取长度和/或加工性的取代，减少脉冲间距离的取代，增强包括聚合酶和核酸底物的二元复合物和/或包括聚合酶、核酸底物和同源核苷酸或核苷酸类似物的三元复合物的热稳定性和/或稳定性的取代。因此，优选地，未对phi29dna聚合酶进行修饰以影响前述特性中的任一种或多种，并且其不包含us2017/0159033中建议的用于将phi29dna聚合酶转化为具有rna依赖性的dna聚合酶活性的酶的示例性取代的任一种或多种。
然而，根据本发明的此方面的phi29dna聚合酶根据某些实施方式可以包含出于不同目的(即除了增加其逆转录酶活性以外)引入的一种或多种替代修饰，例如为了改变其其它生化特性中的一种或多种，和/或增强酶的重组表达和/或纯化(即提高其产量)。
根据某些实施方式，相对于野生型序列，phi29dna聚合酶的序列可以不被修饰。根据一个具体实施方式，phi29dna聚合酶的序列因此可以是野生型或天然序列。换句话说，phi29dna聚合酶的序列可以是非突变序列。
在一个具体实施方式中，根据本发明的此方面的phi29dna聚合酶可以具有阐述于seqidno:268中的序列，或与其具有至少95、96、97、98或99％序列同一性的序列。
模板核酸分子因此包含至少一个核糖核苷酸，并且本发明的此方面的方法包括产生dna分子，该dna分子包含或具有与模板核酸分子互补的序列。
在这些方面，优选的是模板核酸分子包含不超过4个，并且优选不超过3个或2个连续核糖核苷酸(参见上文论述，其也适用于此上下文)。尽管当连续核糖核苷酸的数量不超过2时在某些情况下可能会获得更好的结果，但是应理解，该方法的常规优化是可能的，特别是在环状模板的情况下，使得并不需要限制连续核糖核苷酸的数量不超过2。在某些实施方式中，模板核酸分子因此可以包含1、2、3或4个连续核糖核苷酸。
这在下文实施例中得到了证明。模板分子在多个位点可以含有核糖核苷酸，并且核糖核苷酸的总数不是关键或限制性的。因此，模板核酸分子在两个或更多个分开或不同的位点的每一个处可以包含不超过4个(即4、3、2或1个)核糖核苷酸。在一个实施方式中，模板核酸分子可以包含一个或多个单一核糖核苷酸，即在其5'和3'侧由脱氧核糖核苷酸侧接的核糖核苷酸，在超过一个如本文其它地方所述的位置。每个核糖核苷酸位点因此由之间的一个或多个脱氧核糖核苷酸分隔。在某些实施方式中，两个位点可以仅由单一脱氧核糖核苷酸分隔。
在又一个实施方式中，模板核酸分子可以仅在模板核酸分子内的单一位点处包含核糖核苷酸。在一个具体实施方式中，模板核酸分子可以仅包含单一核糖核苷酸。
连续核糖核苷酸可以优选是嘧啶核苷酸而不是嘌呤核苷酸，因为在下文的实施例中已证明phi29对于扩增模板中的嘧啶核糖核苷酸(即c和u)具有更好的加工性和更高的复制精度。
在本发明的此特定方面，优选的是模板核酸分子包含至少一种核糖核苷酸，而不是其化学修饰、类似物或衍生物。因此，在某些优选的实施方式中，核糖核苷酸不是2'-o-me修饰的核糖核苷酸、2'-f修饰的核糖核苷酸或锁核酸(lna)。
可以调节上文所述的taq和bst聚合酶的最佳逆转录酶活性所必需的因素，诸如盐或特定金属阳离子例如mn2 的浓度，以优化phi29逆转录酶活性。phi29对较长段的核糖核苷酸和/或嘌呤rna碱基的活性可以通过改变rca反应条件来提高。
当然，包含rna和dna碱基的嵌合模板分子可以通过连接根据本发明的探针来产生。然而，本发明的此方面不限于将phi29用于扩增根据本文的方法的连接探针，并且包括用于扩增包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的任何嵌合分子。这种嵌合dna-rna分子可以是环状分子并且可以是任何环状或环化探针。因此，在任何情况下，phi29聚合酶都可以用于扩增无论如何产生的任何环化探针(例如锁式探针、ilock、分子倒置探针、选择探针等)。例如，探针可以是用rna填充缺口的分子倒置探针，或与含有rna的靶分子杂交的选择探针等。因此，在某些优选的实施方式中，模板核酸分子可以是环状模板，例如，如根据本文公开的任何方法形成。
其它应用领域可以包括如上文提及的寡核苷酸生产和下一代测序，以及基于rna的治疗法。
通常地，能够检测扩增的连接产物的存在的任何方便的方案可以用于本发明的检测方法中。检测方案可能需要或可能不需要分离步骤。本文中提及检测扩增的连接产物是指检测通过探针和/或其补体的连接形成的序列(即其互补序列)。
扩增的连接产物(即扩增产物)可以使用任何方便的方案来检测，其中所采用的特定方案可以非特异性或特异性地检测扩增的连接产物，如下文更详细地描述。例如，可以直接检测扩增的连接产物，例如使用凝胶电泳，或更优选地通过杂交与扩增的连接产物杂交的经标记的检测寡核苷酸。可替代地，可以间接检测扩增产物，例如通过pcr扩增产物并且可以检测扩增产物。
感兴趣的代表性非特异性检测方案包括采用信号产生系统的方案，所述信号产生系统例如经由插入选择性地检测单链或双链dna产物。可用于此类实施方式中的代表性可检测分子包括荧光核酸染色剂(诸如菲啶鎓染料)，包括其单体或同二聚体或异二聚体，其在与核酸复合时产生增强的荧光。菲啶鎓染料的实例包括乙锭均二聚体、溴化乙锭、碘化丙啶和其它烷基取代的菲啶鎓染料。在本发明的另一个实施方式中，核酸染色剂是或掺入吖啶染料或其同二聚体或异二聚体，诸如吖啶橙、吖啶同二聚体、乙啶、吖啶异二聚体或9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶。在本发明的又一个实施方式中，核酸染色剂是吲哚或咪唑染料，诸如hoechst33258、hoechst33342、hoechst34580(bioprobes34，molecularprobes公司，俄勒冈州尤金(2000年5月))dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)或dipi(4',6-(二咪唑啉-2-基)-2-苯基吲哚)。其它允许的核酸染色剂包括但不限于7-氨基放线菌素d、羟芪巴脒、lds751、选定的补骨脂素(呋喃香豆素)、苯乙烯基染料、金属络合物(如钌络合物)，以及过渡金属络合物(例如掺入tb3 和eu3 )。在本发明的某些实施方式中，核酸染色剂是菁染料或菁染料的同二聚体或异二聚体，其在与核酸缔合时提供增强的荧光。可以使用描述于授予lee的美国专利号4,883,867(1989)、授予yue等人的美国专利号5,582,977(1996)、授予yue等人的美国专利号5,321,130(1994)，以及授予yue等人的美国专利号5,410,030(1995)(全部四个专利通过引用并入)中的任何染料，包括可以商标toto、bobo、popo、yoyo、to-pro、bo-pro、po-pro和yo-pro从俄勒冈州尤金市的molecularprobes公司商购获得的核酸染色剂。可以使用描述于授予haugland等人的美国专利号5,436,134(1995)、授予yue等人的美国专利号5,658,751(1997)，以及授予haugland等人的美国专利号5,863,753(1999)(全部三个专利通过引用并入)中的任何染料，包括可从俄勒冈州尤金市的molecularprobes公司以商标sybrgreen、evagreen、syto、sytox、picogreen、oligreen和ribogreen商购获得的核酸染色剂。
在本发明的又其它实施方式中，核酸染色剂是单体、同二聚体或异二聚体菁染料，其掺入氮杂或聚氮杂苯并吲哚鎓杂环，诸如氮杂苯并恶唑、氮杂苯并咪唑或氮杂苯并噻唑，其在与核酸缔合时提供荧光增强，包括可以商标syto、sytox、jojo、jo-pro、lolo、lo-pro可从俄勒冈州尤金市molecularprobes公司商购获得的核酸染色剂。
在又其它实施方式中，通常对扩增的连接产物而不是核酸分子具有特异性的信号产生系统可以用于检测扩增。在这些实施方式中，信号产生系统可以包括特异性结合在扩增的连接产物中发现的序列(即报告子结构域序列)的核酸或寡核苷酸，其中核酸/寡核苷酸可以用可直接或间接检测的标记来标记。在具体实施方式中，扩增的连接探针可以通过连接测序来检测。
可直接检测的标记是在不使用其它试剂的情况下可以直接检测的标记，而可间接检测的标记是可通过使用一种或多种额外试剂来检测的标记，例如其中标记是由两个或多个组件组成的信号产生系统的成员。
在许多实施方式中，标记是可直接检测的标记，其中感兴趣的可直接检测的标记包括但不限于：荧光标记、放射性同位素标记、化学发光标记等。在许多实施方式中，标记是荧光标记，其中用于此类实施方式中的标记试剂是一个或多个荧光标记的核苷酸，例如荧光标记的ctp(诸如cy3-ctp、cy5-ctp)等。可以用于标记核苷酸以产生标记的探针核酸(即检测探针)的荧光部分包括但不限于：荧光素、花青染料，诸如cy3、cy5、alexa555、bodipy630/650等。如本领域中已知的，也可以采用其它标记，诸如上文所述的那些。
在某些实施方式中，特异性标记的核酸(检测探针)用“能量转移”标记来标记。如本文所用，“能量转移”是指通过荧光修饰基团改变荧光基团的荧光发射的过程。能量转移标签是本领域熟知的，并且此类标记的寡核苷酸探针包括
因此，可以使用任何方便的方案来确定扩增的连接产物的存在。可以针对任何所得扩增的连接产物的存在筛选等(即测定、评估、评价、测试等)反应混合物，以便检测所测定样品中靶核酸分子的存在。具体的检测方案可以根据所期望的灵敏度和实践该方法的应用而变化。
可以以多种不同方式检测扩增的连接产物。例如，掺入扩增的连接产物中的核苷酸可以被直接标记，例如，荧光或以其它方式分光光度，或放射性同位素标记或用任何信号产生标记，使得扩增的连接产物被直接标记。在一些实施方式中，如上文所述的检测探针，例如荧光标记的探针、分子信标(如上文所述)等可以用于检测扩增的连接产物的存在，其中这些探针针对存在于连接产物(即通过所述连接形成或在所述连接期间形成)中并且因此仅完整存在于扩增的连接产物中的序列(例如报告子结构域序列)。
在本发明方法的此检测步骤中制备的反应混合物可以进一步包括水性缓冲介质，所述水性缓冲介质包括一价离子源、二价阳离子源和缓冲剂。可以采用任何方便的一价离子源，诸如kcl、醋酸钾、醋酸铵、谷氨酸钾、nh4cl、硫酸铵等。二价阳离子可以是镁、锰、锌等，其中阳离子将典型地是镁。可以采用任何方便的镁阳离子源，包括mgcl2、醋酸镁等。存在于缓冲液中的mg2 量可以在0.5至10mm的范围内，但可以使用更高或更低的量并且可以取决于反应类型。例如，对于pcr，存在于缓冲液中的mg2 量可以是约1.5mm，而对于rca，存在于缓冲液中的mg2 量可以是约10mm。可能存在于缓冲液中的代表性缓冲剂或盐包括tris、tricine、hepes、mops等，其中缓冲剂的量典型地在约5至150mm，通常约10至100mm，以及更通常约20至50mm的范围内，其中在某些优选的实施方式中，缓冲剂将以足以提供在约6.0至9.5范围内的ph的量存在，其中最优选在72℃为ph7.3。可能存在于缓冲介质中的其它试剂包括螯合剂，诸如edta、egta等。
本方法的下一步骤是从感兴趣的标记产物中检测信号，其中信号检测可能根据所采用的特定信号产生系统而变化。在某些实施方式中，仅确定可检测信号(例如荧光)，并且将其用于主题测定中，例如确定或鉴定扩增的连接产物以及因此靶核酸分子的存在或不存在。根据所采用的特定标记，信号检测可以指示靶核酸分子中靶核酸序列的存在或不存在。
在信号产生系统是荧光信号产生系统的那些实施方式中，信号检测典型地包括检测来自反应混合物的荧光信号的变化以获得测定结果。换句话说，评估由反应混合物产生的荧光信号的任何调节。根据所采用的标记的性质，变化可以是荧光的增加或减少，但是在某些实施方式中是荧光的增加。可以使用任何方便的手段，例如合适的荧光计，诸如热稳定比色皿或读板荧光计，对样品的荧光增强进行筛选，或者例如在样品是显微镜载玻片上的组织样品时，荧光可以使用荧光显微镜检测。使用已知的荧光计合适地监测荧光。将来自这些设备的信号(例如呈光电倍增管电压的形式)发送到数据处理器板，并且转换为与每个样品管相关的频谱。可以同时评估多个试管，例如96个试管。因此，在一些实施方式中，可以并行检测多个分析物，而在其它实施方式中，可以依序检测多个分析物，例如一次一个分析物或一次一组分析物。
在检测方案是实时方案的情况下，例如，如在实时pcr反应方案中所采用的，可以在整个反应过程中以频繁的间隔，例如每3分钟一次，以此方式收集数据。通过在每个循环期间监测来自样品的反应性分子的荧光，可以以各种方式监测扩增反应的进程。例如，可以分析熔融峰提供的数据，例如通过计算熔融峰下的面积，并且相对于循环数绘制这些数据。
以此方式产生的光谱可以例如使用预选的荧光部分(诸如染料)的“拟合”进行解析，以形成代表每个信号产生部分(即荧光团)的峰。可以确定峰下的面积，所述面积代表每个信号的强度值，并且如果需要，可以表示为彼此的商。信号强度和/或比率的差异将允许记录在整个反应中或在不同的反应条件(例如温度)下标记探针的变化。该变化与寡核苷酸探针与靶序列之间的结合现象或结合靶序列的寡核苷酸探针的降解有关。差分峰下面积的积分将允许计算标记效应的强度值。
筛选混合物的荧光变化提供一个或多个测定结果，这取决于样品是在引物延伸反应结束时筛选一次或例如在扩增反应的每次循环后筛选多次(例如，如在实时pcr监测中进行)。如上文所述生成的数据可以以各种方式来解释。以其最简单的形式，在扩增反应的过程中或结束时，来自样品的荧光增加或减少指示样品中存在的目标分析物的量增加，例如，如与反应混合物中检测到的扩增的连接产物的量相关联，表明扩增反应已经进行并且因此实际上在初始样品中存在靶核酸分子的事实。定量也可以通过在整个扩增过程中监测扩增反应进行。定量还可以包括测定反应混合物中的一种或多种核酸对照，如上文所述。
以此方式，可以容易地筛选(或评估或测定等)反应混合物中扩增产物的存在，并且因此筛选一个或多个靶核酸分子的存在。所述方法适用于检测单一靶核酸分子以及多重核酸分子，其中在样品中测定了两个或更多个不同的靶核酸分子。在这些后面的多重情况下，可以采用的不同探针的数量典型地在约2至约20个或更多个的范围内，例如，至多100或更多个、1000或更多个等，其中样品中的多个分析物可以并行或依序地检测。使用多个不同探针同时并且在单一反应中分析多个分析物(复用)可以通过增加的灵敏度，以及在某些实施方式中增加的特异性来增强，所述特异性可以使用本发明的方法和探针获得。每个探针组可以设计成产生连接产物，所述连接产物可以用于确定最终被探针探询的分析物的存在或不存在、数量和/或位置。
可以使用从文献中已知的用于分析核酸分子的任何成熟的方法来检测扩增的连接探针，所述方法包括液相色谱、电泳、质谱、显微镜、实时pcr、荧光探针、微阵列、比色分析(诸如elisa)、流式细胞术、质谱法(cytof)等。
检测扩增的连接探针进一步包括确定扩增的连接探针的序列。因此，在某些实施方式中，检测可以包括对全部或部分扩增的连接探针测序。本发明的探针和方法可以如上文所述均质地(即在溶液中)使用，或者可替代地使用固相异质地使用，例如，其中靶核酸分子变成固定在固相上，从而允许使用洗涤步骤。这可能是由于例如在原位检测程序中，靶核酸分子的固定所致。使用固相测定提供了优势，特别是对于困难样品的检测：洗涤步骤可以帮助移除未结合和/或未连接的探针等，抑制组分，并且可以从不期望的大体积样品中富集靶分子。可以使用更高浓度和更多量的探针，因为未结合的探针和rna分子可以通过洗涤移除。
在本发明的一个优选实施方式中，靶核酸分子是原位检测的。这可以允许直接检测样品中靶核酸分子的水平、位置或定位。样品因此可以优选地是反映靶核酸分子的正常或天然(“原位”)定位的任何样品，即靶核酸分子正常或天然存在的任何样品。这种样品将有利地是细胞或组织样品。特别优选的是诸如以下的样品：培养的或收获的或活检的细胞或组织样品，其中可以检测靶核酸分子以揭示靶核酸分子相对于样品其它特征的定位。除了细胞或组织制剂之外，此类样品还可以包括例如脱水或固定的生物流体，以及核材料，诸如染色体/染色质制剂，例如在显微镜载波片上。样品可以是新鲜制备的，或者它们可以以任何方便方式进行预处理，诸如通过固定或冷冻。因此，可以使用新鲜、冷冻或固定的细胞或组织，例如ffpe组织(福尔马林固定石蜡包埋)。
在替代的实施方式中，可以固定靶核酸分子。将靶核酸分子固定在固相上可以以多种方式实现。因此，设想了固相测定的几个实施方式。在一个这种实施方式中，分子可以首先被固定的(或可固定的)捕获探针捕获，可以产生扩增的连接产物，使得其连接至靶核酸分子，例如借助于用于扩增的引物是靶核酸分子或连接至靶核酸分子，如本文其它地方所述。可替代地，可以将扩增的连接产物简单地固定至固体支持物。例如，在扩增之前，用于扩增的引物可以具有可固定的基团或部分或固定构件，或者可以被固定。
固定的捕获探针、靶核酸分子、用于扩增的引物，或扩增的连接产物可以以任何方便的方式固定，即结合支持物。因此，可以根据选择从如本领域中广泛已知和文献中所述的任何数量的固定构件和固体支持物中选择固定方式和手段以及固体支持物。因此，捕获探针、靶核酸分子、用于扩增的引物，或扩增的连接产物可以直接结合至支持物(例如化学交联)，它可以通过连接基团，或通过一个或多个中间结合基团(例如通过生物素-链霉亲和素相互作用)结合。因此，捕获探针、靶核酸分子、用于扩增的引物，或扩增的连接产物可以具有提供在支持物上的用于固定的构件(例如亲和力结合配偶体，例如生物素或半抗原或核酸分子，其能够结合其结合配偶体，即同源结合配偶体，例如链霉亲和素或抗体或核酸分子)。可以在结合分析物之前或之后固定捕获探针。此外，可以将这种“可固定的”捕获探针与样品以及支持物接触。
类似地，可以在扩增之前或之后固定用于扩增的引物。捕获探针可以是例如能够特异性结合靶核酸分子的核酸分子。换句话说，捕获探针可以是对靶核酸分子具有特异性的固定的(或可固定的)探针，所述靶核酸分子包含与其互补的结合结构域。因此，在这种实施方式中，首先通过固定的或可固定的捕获探针捕获靶核酸分子，所述探针仅用于将靶核酸分子固定在固相上，并且然后使固定的靶核酸分子进行检测方案，所述检测方案使用或导致扩增的连接产物的产生。更特别地，这种捕获探针特异性结合分析物。
固体支持物可以是目前广泛使用或提议用于固定、分离等的任何熟知的支持物或基质。这些可以采取颗粒(例如可以是磁性或非磁性的珠粒)、片材、凝胶、过滤器、膜、纤维、毛细管或微量滴定条、管、板或孔等的形式。
支持物可以由玻璃、二氧化硅、乳胶或聚合材料制成。合适的是为分析物结合呈现高表面积的材料。此类支持物可以具有不规则表面并且可以是例如多孔的或颗粒状的，例如颗粒、纤维、纤维网、烧结物或筛。颗粒状材料(例如珠粒)由于其较大的结合能力而是有用，特别是聚合物珠粒。
方便地，根据本发明使用的颗粒状固体支持物将包含球形珠粒。珠粒的尺寸并不关键，但是它们可以例如是至少1μm并且优选至少2μm的直径量级，并且具有优选不超过10μm，并且例如不超过6μm的最大直径。
单分散颗粒，即尺寸基本均匀的颗粒(例如直径标准偏差小于5％的尺寸)具有提供非常均匀的反应再现性的优点。代表性单分散聚合物颗粒可以通过us-a-4336173中所述的技术生产。
然而，为了帮助操纵和分离，磁珠是有利的。如本文所用，术语“磁性”意指当被置于磁场中时能够赋予其磁矩(即顺磁性)，并且因此在该场的作用下可移动的支持物。换句话说，可以容易地通过磁团聚移除包含磁性颗粒的支持物，所述磁团聚提供在结合步骤之后分离颗粒的快速、简单和有效的方式。
在另一个实施方式中，靶核酸分子本身可以例如通过非特异性吸收固定(或可固定)在固相上。在一个具体的这种实施方式中，分析物可以存在于细胞内，任选地经固定和/或透化，所述细胞(能够)附着于固体支持物，例如可以将包含分析物的组织样品固定在显微镜载玻片上。
如上文所提及，本发明还提供了用于本发明方法中的某些探针，即如上文所定义的可环化探针，其可以以一个或多个部分提供。本发明因此提供了如本文所定义的嵌合dna-rna锁式探针，其包括侵入锁式探针。
在一个这种实施方式中，嵌合dna-rna锁式探针是单一可环化寡核苷酸，其包含位于所述探针的5'末端处或内部的第一靶标特异性靶结合位点和位于所述探针的3'末端处的第二靶标特异性结合位点，并且其中：
(i)所述第二靶标特异性结合位点包含一个或多个核糖核苷酸；
(ii)在所述第一靶标特异性结合位点在所述探针的5'末端内部的情况下，所述探针包含所述第一靶标特异性结合位点的附加序列5'，使得当所述探针与所述靶核酸分子杂交时，所述附加序列形成5'活瓣，所述5'活瓣不与所述靶核酸分子杂交，并且可以通过切割移除以产生可连接5'末端，所述可连接5'末端可以连接至所述探针的3'末端以环化所述探针，其中所述附加序列可以任选地含有一个或多个核糖核苷酸；
(iii)所述探针在连接以形成环时主要由dna构成并且包含不超过4个连续核糖核苷酸。
在另一个实施方式中，嵌合dna-rna锁式探针包括两个或更多个部分，即为主链寡核苷酸的第一部分，其包含位于其5'末端处或内部的第一靶标特异性靶结合位点和位于其3'末端处的第二靶标特异性结合位点，以及一个或多个缺口寡核苷酸，所述一个或多个缺口寡核苷酸各自包含与所述主链寡核苷酸的所述第一靶标特异性靶结合位点与所述第二靶标特异性结合位点之间的所述靶核酸分子互补并且能够与所述靶核酸分子杂交的靶标特异性结合位点，并且其中：
(i)所述主链寡核苷酸的所述第二靶标特异性结合位点和/或至少一个缺口寡核苷酸的所述靶标特异性结合位点处在其3'末端处包含一个或多个核糖核苷酸；
(ii)在所述第一靶标特异性结合位点在所述主链寡核苷酸的5'末端内部的情况下，所述主链寡核苷酸包含所述第一靶标特异性结合位点的附加序列5'，使得当所述主链寡核苷酸与所述靶核酸分子杂交时，所述附加序列形成5'活瓣，所述5'活瓣不与所述靶核酸分子杂交，并且可以通过切割移除以产生可连接5'末端，所述可连接5'末端可以连接至缺口寡核苷酸的3'末端以环化所述探针，其中所述附加序列可以任选地含有一个或多个核糖核苷酸；
(iii)一个或多个缺口寡核苷酸任选地包含所述靶标特异性结合位点的附加序列5'，使得当所述缺口寡核苷酸与所述靶核酸分子杂交时，所述附加序列形成5'活瓣，所述5'活瓣不与所述靶核酸分子杂交，并且可以通过切割移除以产生可连接5'末端，所述可连接5'末端可以连接至另一个缺口寡核苷酸的3’末端或所述主链寡核苷酸的3'末端以环化所述探针，其中所述附加序列可以任选地含有一个或多个核糖核苷酸
(iv)所述主链和缺口寡核苷酸在连接时形成环，所述环主要由dna构成并且包含不超过4个连续核糖核苷酸。
此类探针可以是侵入锁式探针，在本文中也称为ilock探针。在某些实施方式中，本发明的探针(即以单一可环化寡核苷酸提供的探针，或以两个或更多个部分提供的探针的部分，即主链寡核苷酸和/或一个或多个缺口寡核苷酸)因此可以包含如本文所述的所述第一靶标特异性结合位点或缺口寡核苷酸的靶结合位点的附加序列5'，其中形成5'活瓣的任何附加序列的3'末端处的核苷酸与所述靶核酸分子中与所述探针、或主链寡核苷酸和/或一个或多个缺口寡核苷酸的3'末端(即探针的相邻部分的可连接末端)处的核苷酸相同的同源核苷酸互补。当此类探针与靶核酸分子杂交时，形成5'活瓣的附加序列的3'末端处的核苷酸因此由探针或主链寡核苷酸和/或一个或多个缺口寡核苷酸的3'可连接末端防止与靶核酸分子杂交。
此类侵入探针可以适合于检测靶核酸分子中的变体碱基。在用于检测靶核酸分子中的变体碱基的探针中：
(i)上文所述的所述探针或主链寡核苷酸和/或缺口寡核苷酸的3'末端处的核苷酸和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与变体碱基互补，并且所述附加序列的3'末端处的核苷酸不能与所述探针或主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸的3'末端同时与所述靶核酸分子杂交，使得可以通过切割移除所述附加序列以产生所述探针的5'可连接末端；或者
(ii)所述附加序列的3'末端处的核苷酸和所述探针或主链寡核苷酸和/或缺口寡核苷酸的3'末端处的核苷酸不与所述变体碱基互补，使得所述探针，或主链寡核苷酸和/或缺口寡核苷酸的3'末端处的核苷酸不能与所述靶核酸分子杂交，从而防止连接，并且所述附加序列的3'末端处的核苷酸还可以通过切割移除。
可替代地，在用于检测靶核酸分子中的变体碱基的探针中：
(i)所述第一靶标特异性结合位点的5'末端处或主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸的所述靶标特异性结合位点的5'末端处的核苷酸与所述变体碱基互补，上文所述的所述探针或主链寡核苷酸和/或缺口寡核苷酸的3'末端处的核苷酸和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与所述变体碱基的位置3'处的核苷酸互补，并且所述附加序列的3'末端处的核苷酸不能与所述探针或主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸的3'末端同时与所述靶核酸分子杂交，使得可以通过切割移除所述附加序列以产生所述探针的5'可连接末端；或者
(ii)所述第一靶标特异性结合位点的5'末端处或主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸的所述靶标特异性结合位点的5'末端处的核苷酸不与所述变体碱基互补，也通过切割移除所述核苷酸，从而在5'可连接末端与3'可连接末端之间产生缺口并且防止连接。
在一个优选的实施方式中，形成5'活瓣的附加序列的3'末端处的核苷酸是核糖核苷酸。
在另一方面，本发明提供一组侵入探针，其包含两个或更多个侵入探针，用于检测靶核酸分子中的变体碱基，其中所述探针组中的每个探针在附加序列和与变体碱基互补的探针或主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸的3'末端中的位置处包含不同的核苷酸(例如a、g、c或t/u)。在某些实施方式中，侵入探针组可以包含三个或四个探针，每个探针在所述位置处包含不同的核苷酸。
如上文所论述，探针中核糖核苷酸的总数不是关键的，只要该探针在连接时含有不超过4个或更优选不超过3个或2个连续核糖核苷酸(参见上文论述)。
在某些实施方式中，在单个部分探针的3'末端处或主链寡核苷酸的3'末端处的第二结合位点，或缺口寡核苷酸的靶标特异性结合位点可以包含不超过4个或5个核糖核苷酸。
附图说明
参照实施例和图可以更好地理解本发明，其中：
图1示出了在由rna模板化的锁式探针的连接中，使用pbcv-1连接酶在连接位点处的3'可连接末端处的rna核苷酸的作用。a：实验概述。b：用rna或dna末端3'核苷酸设计靶向let-7家族成员的锁式探针(plp)。使探针与匹配模板杂交，与pbcv-1连接并且扩增。每个plp/mirna对的rca产物(rcp)总数示于柱形图中。y轴示出rcp的数量，而mirna的类型在x轴上描绘。误差条±标准误差；n＝2。
图2示出了使用pbcv-1或t4rnl2连接酶在连接位点处的3'可连接末端处的rna核苷酸的作用。比较了使用rna模板，3'-oh(n)/5'-p(n)相对于3'-oh(rn)/5'-p(n)的连接。使完整的dna和嵌合锁式探针与对应的rna靶标杂交，并且与(a)pbcv-1和(b)t4rnl2连接。y轴示出了滚环产物(rcp)的数量并且x轴示出了所用rna模板。误差条±标准误差；n＝2。当探针在其3'末端处包含3'核糖核苷酸时，对于pbcv-1，针对所有靶rna看到较大数量的连接产物，并且对于t4rni2连接酶，针对所有靶rna看到连接产物的数量均大幅增加。
图3示出了3'-oh(rn)错配对通过pbcv-1和t4rnl2连接酶进行切口密封的影响。将每种rna模板的rcp数量(图3b和3c)加和，并且以每种连接酶的ilock探针组内的百分比(图3a)表示。
图4示出了在用于使用pbcv-1连接酶的rna检测测定中的侵入锁式(ilock)探针中各个位置的rna替代的作用。taqdna聚合酶对侵入结构和结构特异性溶核活性的识别可以因不同的rna取代而变化。a：使用ilock探针靶向let-7a，示出ilock探针的第一和第二靶标特异性结合位点，以及5'附加序列的排列。将rna核苷酸引入不同位置处：末端3'末端(3)处；5'活瓣中与探针末端处的末端3'核苷酸竞争靶结合的3'最远端核苷酸(置换碱基，d)；切割以移除附加序列(ilock探针活化)之后成为5'可连接末端(提供5'-磷酸化供体)的第一个靶结合位点的碱基(5)；整个活瓣序列(f)。b：评估了六个ilock设计的环化：仅dna的ilock；具有(3)修饰的ilock(ilock-3)；具有(3)和(d)修饰的ilock(ilock-3d)；具有(3)、(d)和(5)修饰(ilock-3d5)的ilock；具有(3)、(d)和(f)修饰的ilock(ilock-3df)；以及具有(d)和(f)修饰的ilock(ilock-df)。针对每个ilock探针检测到的rcp总数在x轴上示出。相对于仅dna的ilock，包含(3)修饰，和(3)修饰与(d)或(d)和(f)修饰的组合的探针示出产生的rcp数量大幅增加。相对于仅dna的ilock，(3)修饰与(d)和(5)修饰，以及(d)和(f)修饰的组合示出产生的rcp相对数量的增加小得多。c：在无(第1-3条泳道)和有taqdna聚合酶(第4-6条泳道)的情况下，活化和连接之后ilockdna、ilock-3和ilock-3d探针的page。未活化的ilock探针(79)在活化后缩短14nt(65)并连接(见凝胶顶部的高分子量带)。泳道4：经活化的未连接探针的带是可见的(65nt)，未裂解的探针的带清晰可见(79nt)，并且仅可见连接探针的微弱带。泳道5：没有未连接探针的带是可见的，未裂解的探针的带清晰可见(65nt)，并且连接探针的带是可见的。泳道6：没有未连接探针的带是可见的，未裂解的探针的带是微弱的(65nt)，并且连接探针的强带是可见的。连同这些数据示出，连接位点处的3'可连接末端处的核糖核酸酶改善连接(泳道4和5)，并且在侵入测定中被切割的附加序列中的最3'末端位置处的核糖核酸酶改善切割(泳道5和6)。
图5示出了嵌合和非嵌合ilock探针连接的比较。a：3d和非嵌合ilock探针在较长非mirna靶标上的性能。匹配多态模板上每个探针的rcp总数在y轴上示出。b：使用pbcv-1和t4rnl2，嵌合和非嵌合ilock探针对mir21的比较.嵌合或非嵌合ilock探针的rcp总数在y轴上呈现。所用的连接酶在x轴上描绘。误差条±标准误差；n＝2。当使用嵌合探针时，两种连接酶均显示改善的连接。
图6示出了对于pbcv-1和t4rnl2连接酶，在非mirna模板上嵌合ilock探针的连接效率和保真度。a和b：在匹配的多态rna模板上pbcv-1和t4rnl2连接酶的切口密封的保真度。c和d：数据呈现在(a)和(b)中，但呈现为每个多态模板上每个ilock探针生成的rcp总数。误差条±标准误差；n＝2。
图7示出了使用嵌合ilock探针和pbcv-1连接酶对let-7mirna同种型的多重检测。a：将mirna特异性条形码(nn)嵌入在探针主链中，在锚定引物杂交区域与测序文库杂交位点之间。在测序期间，锚定引物(ap)与rcp杂交，并且测序文库寡核苷酸池基于其5'末端处的核苷酸相互竞争进行杂交。含有末端t的文库经3'-fitc标记；g-3'cy3标记；a-3'cy5标记。连接酶接合对应于条形码碱基的文库寡核苷酸。b：通过连接测序(sbl)对第一条形码碱基的成像.ap：所有用ap染色的rcp。呈现每个条形码碱基的图像以及合并的图像。误差条5μm。c：如在x轴上所陈述，以化学计量比混合mirna。1:1:1表示相等的比率并且0:0:0表示无模板对照。读取总数在y轴上示出。误差条±标准误差；n＝成像的样品数＝2。对于每个模板，1:1:3比率产生类似数量的rcp。
图8示出了使用(a)rna模板或(b)dna模板，在高和低浓度下，对于pbcv-1连接酶和t4rnl2连接酶，锁式探针和在3'末端处包含1(r1pd)或2(r2pd)核糖核苷酸的嵌合锁式探针的连接效率的比较。对于两种连接酶，针对rna和dna靶标，嵌合锁式探针示出比仅dna的锁式探针更有效地连接和扩增。
图9示出了使用dna锁式探针或嵌合锁式探针原位检测kraswt和突变rna。a：显微镜图像，其示出了使用锁式探针(顶部)或嵌合锁式探针(底部)对突变和wtrna的检测。b：在细胞系a549和oncodg1中每个细胞的突变rcp和野生型rcp的平均数。在两种情况下，嵌合锁式探针的效率都高得多。特异性高到足以区分突变型和野生型kras(a549中有更多的突变rcp并且oncodg1中有更多的野生型rcp)。
图10示出了使用嵌合ilock探针原位检测kraswt和突变rna。a：显微镜图像，其示出了使用嵌合ilock探针对突变和wtrna的检测。b：在细胞系a549和oncodg1中每个细胞的突变rcp和野生型rcp的平均数。特异性高到足以区分突变型和野生型kras(a549中有更多的突变rcp并且oncodg1中有更多的野生型rcp)。
图11示出了使用缺口填充聚合和ilock探针对靶rna分子的检测。a：使用嵌合ilock探针，在与逆转录酶缺口填充聚合，和taq裂解 pbcv-1连接酶连接(均一次性)然后rca之后，溶液中计数的rcp数量。b：使用缺口填充聚合和嵌合ilock探针对rcp的原位检测。
图12示出了2部分ilock探针的设计，所述探针在主链和缺口寡核苷酸的末端处包含核糖核苷酸。使靶rna分子(1)与包含主链寡核苷酸(2)和缺口填充寡核苷酸(3)的2部分ilock探针接触。主链寡核苷酸和缺口填充寡核苷酸均在其5'末端包含不与靶rna分子杂交的附加序列(4)并且在其3'末端包含核糖核苷酸(5)。
图13示出了rna取代对使用phi29dna聚合酶的滚环扩增的影响。a：在有/无末端3'rna且不存在合成rna连接模板(模板-)的情况下，锁式探针产生的rca总量(y轴)。b：在主链中具有0-7个rna取代的环被扩增并进行数字计数。y轴示出了滚环产物(rcp)的数量；误差条±标准误差；n＝2。还以在qpcr仪器上实时测量sybr金掺入来监测与嵌合环的相同rca反应(c和e)。c：具有0、1、2或3个rna取代基的环的rca反应曲线。d：将来自c的rcp在显微镜载玻片上成像，并且定量单独rcp的大小和强度。黑线，中位数；上须，在铰合部四分位间距1.5内的最大值；下须，在铰合部四分位间距1.5内的最小值。e：显示了与b中相同，使用0-7个rna取代基的rca反应的实时数据。从重复实验中呈现代表性样品。为了突出rca的初始阶段并且查看具有低rca效率的样品之间的差异，示出了4000与6000之间的荧光。
图14示出，与在其3'末端包含脱氧核糖核苷酸的锁式探针相比，使用pbcv-1连接酶更容易连接包含3'核糖核苷酸的嵌合锁式探针。泳道1-6-嵌合锁式探针泳道7-12-非嵌合锁式探针连接的探针产物以较重的片段(*)示出。对于嵌合探针(泳道2-3)，这在1-2分钟之后清晰可见，而对于非嵌合探针(泳道12)，只有在稍后的时间点才清晰可见。
图15示出了在5'附加序列(4)的3'末端处包含核糖核苷酸(3)的缺口填充锁式探针(2)，所述5'附加序列在连接之前被切割。与靶核酸分子(1)杂交的探针的3'末端(5)可以通过缺口填充聚合而延伸。
图16示出了锁式探针(2)，其在除了与靶核酸分子(1)杂交的连接位点(4)处或附近的位置处包含核糖核苷酸(3)。
图17示出了锁式探针(2)，其包括以两部分提供的主链寡核苷酸，和连接模板(4)，所述连接模板与主链寡核苷酸的每个部分杂交以便模板连接。如所示，在此连接位点中的3'可连接末端处的核苷酸是核糖核苷酸。
图18示出了包含不同核糖核苷酸的环化锁式探针的扩增速率。a：显示了含有所有四个rna碱基的1、2或3个连续rna取代的环的实时rca曲线。通过测量由sybrgold掺入rcp产生的荧光积聚(y轴)来监测rca的速率。示出了每个实验的代表性数据。b：显示了阳性对照(纯dna环-左下图)、阴性对照(无环)和具有2、3、5和7个连续rna取代的环，以及散布在dna碱基之间的rna取代的环的rca速率。使用含有嘧啶rna取代的环，phi29dna聚合酶展现出更高的rca速率。
图19示出，在存在m-mulv逆转录酶的情况下，未回收到富含rna的锁式探针的有限复制。显示了在主链中具有0-7个rna取代的锁式探针的扩增曲线。通过测量由sybrgold掺入rcp产生的荧光积聚(y轴；3000–30000)来监测rca的速率。示出了没有额外逆转录酶(上图)和具有额外m-mulv逆转录酶(下图)的环的复制。
图20示出了显示在rca逆转录期间掺入预期dntp的堆叠图。对含rna的锁式探针扩增、单体化和测序。rca单体是从对照dna环(上排)，和在第一rna位置(r1)含有ra、rc、rg和ru，以及在其r1和r2位置处含有ruru、rara、rcrc和rgrg的环生成的(完整寡核苷酸在表9中)。对准测序读段并且计算每个位置中每个碱基的频率。每个碱基的大小与碱基频率成正比。位置r1和r2(相对于锁式探针主链中的rna位置)由框指示并且突出位置r1(参见箭头)。
图21示出了在培养的人(bjhtert)和小鼠(mef)成纤维细胞中actbmrna的原位检测。a：使用嵌合和非嵌合的嵌合锁式探针(plp)和ilock探针，对bjhtert和mef细胞中人和小鼠actbmrna的检测。两个靶标的探针包括在每个样品中，并且示出了良好的靶标特异性水平。b：使用嵌合和仅dna的plp和ilock，示出了对于每种细胞系，每个探针产生的每个细胞的rcp平均数量。plp：仅dna的锁式探针；plpr–3'-(rn)plp；rilock：rnailock；ilock：仅dna的ilock。对于每个探针，来自人特异性探针的信号位于顶部，而来自小鼠特异性探针的信号位于底部。在bjhtert中，人actb特异性plp(顶部盒形图)示出少于rnaplpr(第二个盒形图)的斑点。小鼠特异性plp和plpr未示出信号。对于ilock(第3个和第4个盒形图)，rilock示出了高于ilock(盒形图略有移位)的中位数，但与plp相比，信号量显著较低。针对mef小鼠细胞获得了对应数据，其中来自小鼠特异性探针的信号高于人特异性探针的信号。
图22示出了固定在固体表面上的mir21rna的原位检测。a：固定mir21并且使互补探针(用荧光染料标记)杂交。有意对硅酮腔室的边缘成像，以可视化固定效果；b)当不添加mir21时，互补探针未产生可见荧光；使用非嵌合plp(c)嵌合plp(e)ilock探针(d)和嵌合ilock探针(f)检测mir21。定量的rcp数量表示为rcp/视场(fov)的总数。
图23示出了使用嵌合锁式探针进行的原位多重rna检测和在小鼠脑组织切片中的原位测序。上图示出了小鼠脑组织切片的概览图像，其中核在dapi中染色并且锚定探针染色的rca产物由靶向18种不同神经元基因的嵌合plp产生(每个基因5个探针，每个＝总计90个不同探针)。下面是左侧概览图像中单独细胞可见的区域。
图24示出了使用含有嘧啶rna取代的环，phi29dna聚合酶展现出更高的rca速率。(a)显示了含有rg、ru、ra、rcrna碱基的1、2、3或4个连续rna取代的环的实时rca曲线(连续取代的数量如曲线所指示)。通过测量由sybr金掺入rcp产生的荧光积聚(y轴)来监测rca的速率。根据重复实验计算每个rca时间点的平均荧光强度。在存在mg2 和mn2 (分别为实线和虚线)的情况下进行rca。(b)在存在mg2 (实线)和mn2 (虚线)的情况下，呈现了来自(a)的plp的线性、早期rca速度(y轴)。(c)显示了在mg2 (实线)和mn2 (虚线)存在下，对照plp(非嵌合dna环)的rca。
图25示出了具有以不同模式组织的rna取代的嵌合环状底物的rca。通过测量由sybrgold掺入rcp产生的荧光积聚(y轴)来监测rca的速率。将4、5和7连续取代(黄色、红色、绿色)；散布在1个或2个dna碱基中的3个、6个rna取代(蓝色、灰色)以及散布在大量dna碱基中的3个和8个rna取代(橙色、品红色)(仅图例)引入plp主链中，如插图(仅描绘主链片段的片段，如所指示的完整plp序列)所示。来自重复实验的平均数据。在存在镁和锰离子(分别为实线和虚线)的情况下进行rca。
图26示出了rna取代对3'-oh(rg)和3'-oh(g)锁式探针稳定性以及与pbcv-1连接酶在rna上的连接的影响。a：pbcv-1连接酶滴定.在30min连接期间，每种连接酶浓度(x轴)生成的rcp总数(y轴).对于每个时间点，嵌合探针的数据示出在左侧并且非嵌合探针的数据示出在右侧。b：为了评估嵌合锁式探针在反应第一分钟期间的稳定性，使用了26.5nm(62mu//μl)的浓度。通过在70℃下热灭活酶10min来终止连接反应。呈现了给定时间点(x轴)的rca产物总数(y轴)。
图27示出了使用pbcv-1和t4rnl2，嵌合和非嵌合ilock探针连接对mir21和let-7f的比较。嵌合(左)或非嵌合(右)的rcp总数。使用pbcv-1或t4rnl2(x轴)，ilock探针呈现在y轴上。呈现mir21和let-7frna模板的数据。
图28示出了3'-oh(rn)错配对ilock活化以及pbcv-1和t4rnl2连接酶的切口密封保真度的影响。a和b：嵌合ilock-3d(左)和非嵌合(右)ilock探针在多态rna靶标上的性能。对于a)pbcv-1dna连接酶和b)t4rnl2，在匹配多态模板上每种探针的rcp总数在y轴上示出。nc-阴性对照。c：使用rna上的3d型ilock探针通过pbcv-1dna连接酶(左图)和t4rnl2(右图)进行切口密封的保真度。将每个rna模板上相同ilock探针的rcp数量加和并且以ilock探针组内的百分比表示。突出了预期探针对的计算比例。
图29示出了pbcv-1和t4rnl2连接酶嵌合ilock探针在多态模板上的连接效率和保真度。对于a)pbcv-1dna连接酶和b)t4rnl2，针对每个多态性模板上每个ilock探针生成和定量的rcp总数(y轴)示于图28中。
图30示出了在rca逆转录期间的dntp掺入。如实施例中所述，对锁式探针单体化、扩增和测序。如接着单独的图所描绘，采用此方法对具有单和双rna碱基的样品测序。对准测序读段并且计算每个位置中每个碱基的频率。每个碱基的大小与碱基频率成正比。如上图所指示，rca反应在存在镁和锰离子的情况下进行。用框指示rna碱基的位置。最初在plp序列中呈现的dna/rna序列在右侧描绘。
图31示出了在rca逆转录期间锁式探针主链中每个位置的错误掺入率。具有单(左侧图)和双rna取代(右侧图)的锁式探针在每个位置处未预期核苷酸错配的概率计算为掺入误差[％]＝1-预期核苷酸的读段/总读段。示出了测序读段的每个碱基(x轴)和每个分析样品的平均误差(y轴)。在存在锰(a)和镁(b)的情况下进行rca反应。
图32示出了环状模板中的rna取代对使用phi29dna聚合酶的滚环扩增的影响。(a)在主链中具有0-7个rna取代的环被扩增并进行数字计数。y轴示出了滚环产物(rcp)的数量；误差条±标准误差；n＝2。还通过在qpcr仪器上测量sybr金掺入来实时监测与嵌合环的相同rca反应(b和c)。(b)具有0、1和2rna取代的环的rca反应曲线。(c)显示了与b中相同，使用0-7个rna取代基的rca反应的实时数据。从重复实验中呈现代表性样品。为了突出rca的初始阶段并且示出具有低rca效率的样品之间的差异，呈现了3000与6000之间的荧光强度读出。
图33示出了基于dna测序的滚环产物分析，揭示了phi29dna聚合酶的逆转录活性。(a)在rca之后，将短的dna寡核苷酸与rca产物中的alui限制位点杂交，并且用alui限制酶消化rcp，得到rca单体。在消化后，使用含有ilumina接头序列的引物对单体进行pcr扩增。使用iilumina索引引物延伸pcr产物。最后，使用索引引物特异性p5/7pcr引物制备测序文库。在原始锁式探针序列中含有rna取代的感兴趣区域用绿色框表示。(b)标志，示出了从对照dna环(p1＝dg)，和在rna位置(p1)处含有单个rg、ru、ra和rc取代的环生成的rca单体内每个位置的测序频率。指示位置p1和p2并且用红色框突出位置p1。(c)对来自(b)的经测序单体中的每个位置掺入不正确核苷酸。呈现了具有单(上部图)和双rna取代(下部图)的锁式探针的错误率，计算为掺入误差[％]＝1-具有预期核苷酸的读段数/总读段数。第一rna取代的p1位置用方框表示。
具体实施方式
实施例
实施例1-使用嵌合的dna/rnailock探针，利用pbcv-1dna连接酶的新活性：rna模板化连接检测mirna
材料和方法
用于本研究中的寡核苷酸
使用的所有寡核苷酸均购自idt(integrateddnatechnologies公司，科勒尔维尔，爱荷华州，美国)，使用以下合成和纯化条件：dna锁式探针和ilock探针：4nm标准脱盐的
锁式探针被设计成使得当碱基与参与的rna靶标配对时，末端臂将形成切口环，并且区分性碱基位于探针的3'末端处(表1)。用于本研究中的mirna锁式探针示于表1中。嵌合锁式探针以末端3'-ohrna排序。出于比较目的将ilock探针用于本工作中(表2)。标准化嵌合ilock探针设计包括末端3'碱基以及5'臂中与3'末端碱基竞争靶标结合的碱基(置换碱基，图4a，表2)上的rna取代。使用了两种类型的探针条形编码方法：传统的和与连接测序读出相容的(用于嵌合，靶向mirna的ilock探针)。对于传统滚环产物(rcp)染色和数位定量，将报告序列嵌入连接探针臂的序列中，与探针臂分离10个腺嘌呤的系列(表2)。对于后者，使用具有独特探针特异性条形码的共有主链(表3)。为了允许条形码解码，将常见的锚定引物序列嵌入探针主链中，之后是两碱基条形码和锚定序列的测序文库(表3)。
扩增的ilock和锁式探针的rna检测测定和数位定量
以4:1探针比模板过量进行ilock活化(切割)(典型地将2nmilock探针与0.5nmrna模板混合)。将一式两份的反应在51℃下在加热盖式热循环仪中以10μl体积温育30min，所述体积含有1utaqdna聚合酶(thermofisherscientific)、4urna酶抑制剂和供应有8mmmgcl2的1×taq聚合酶缓冲液。接着，将3μl样品体积转移至在各自缓冲液中补充有3.75u的pbcv-1dna连接酶(splintr，m0375s，neb)或4u的t4rnl2(m0239s，neb)的连接反应混合物中，最终体积为15μl。在37℃下将反应搅拌30min。对于锁式探针，应用相同的连接条件，但不包括活化步骤。对于rca，将5μl的连接反应物与10nmol装饰探针、0.125mmdntp、0.2μg/μlbsa、250muphi29聚合酶(monseratebiotechnologygroup)和1xphi29反应缓冲液(thermofisher)一起以25μl的最终体积在37℃下温育60分钟。将聚合酶在65℃下加热灭活3分钟并且使其冷却至室温。除非另有说明，否则对于锁式探针和ilock探针，扩增产物的估计最终浓度分别为5pm和20pm。使用aquila400检测单元(q-linea，uppsala)分析15μl的rca样品。如果rcp浓度不在仪器的动态范围内，则将样品在1×标记溶液(20mmedta，20mmtris-hcl(ph7.5)，0.05％tween20和1mnacl)中的4nm装饰探针中稀释，在65℃下温育3min，使其在室温下冷却15min并重新计数。与每个实验并行进行模板阴性反应作为对照。
使用嵌合ilock探针和连接测序进行多重mirna检测
为了测试嵌合ilock探针是否可以用于检测rna混合物中的mirna表达变化，我们已经以(1):(1):(1)、(3):(1):(1)、(1):(3):(1)和(1):(1):(3)比率组合了(let-7f):(let-7e):(let-7d)mirna。在ilock活化步骤期间的基线mirna浓度是0.5nm，而mirna浓度升高的样品的基线mirna浓度是1.5nm。使用2nmlet-7f、let-7e、let-7d嵌合ilock探针的混合物，每个探针嵌入有独特的两核苷酸条形码(表3)和连接测序化学序列。如上文所述(使用pbcv-1连接酶)进行实验，不同之处是将10μlrca产物滴液点样在带正电的显微镜载玻片(superfrostplus，menzel
为了可视化各种嵌合ilock探针的活化和连接效率(表2)，电泳分离产物。如上文处理5μm合成rna和2.5μm探针。在连接后，将50nm样品在
结果
3'-ohrna对pbcv-1dna连接酶rna依赖性连接的影响：对不同rna底物的rna末端接合
我们比较了pbcv-1连接酶环化与let-7a杂交的锁式探针的能力，其中探针的5'末端是dna并且3'末端是dna或rna。虽然充分表征了t4rnl2将嵌合的3'rna受体链与rna上的5'供体链接合的能力，但只有在dna模板上的pbcv-1dna连接酶证明了这一点。通过page分离，我们比较了随反应时间嵌合锁式探针相对于dna锁式探针的连接效率(图14)。此外，我们将连接效率测量为滚环扩增产物(rcp)的总数，对每个挂锁/模板对进行数位计数(图1a)。
当将含3'rna的plp连接到mirna靶标上时，pbcv-1连接酶催化高效的末端接合(图1b)。对于较长的非mirna靶标，嵌合和非嵌合探针的连接效率类似(图2a)。因为rna的存在导致更大的核酸双链体稳定性，所以我们假设在初始反应阶段期间将更快地连接更稳定的双链体。t4rnl2有效连接嵌合锁式探针，而dna锁式探针的活性相对较低(图2b)。我们发现pbcv-1容易接受嵌合锁式探针作为底物，这促使我们系统地表征在中心定位核苷酸中具有多态位置的合成靶标上的连接保真度(图3和表1)。为了测量错配的嵌合底物对pbcv-1和t4rnl2连接酶末端接合活性的影响，将四个末端3'核苷酸(ra、ru、rg、rc)不同的嵌合锁式探针各自与四个不同的rna靶标杂交，连接并且用rca扩增(图3)。pbcv-1连接酶对大多数3'rna错配是高度耐受的(图3a、3b)。另一方面，t4rnl2连接rc/rg(82％)和ra/rc(64％)的准确度中等，但对其它组合的末端接合保真度较差(图3a、3c)。
各种rna取代对rna模板化ilock探针活化、pbcv-1和t4rnl2的连接效率和保真度的影响
在我们先前的研究中，我们利用了用于侵入测定的taqdna聚合酶的结构特异性5'活瓣切割活性来活化锁式探针分子进行连接。我们已经表明，此ilock探针测定增加了基于连接酶的rna检测保真度(krzywkowski，见上文)。因为pbcv-1连接酶对测试的大多数嵌合3'错配具有相当的耐受性，所以我们测试了与dnailock探针相比，在ilock探针的不同位置中rna取代的存在将如何影响探针的活化和连接。设计了多个靶向let-7amirna的ilock探针(表2)，其在各个探针位置中含有rna取代(图4a)。一个嵌合探针(称为“3”)在3'末端具有rna取代。在“3d”探针中，末端3'和5'活瓣的置换碱基被rna取代。“3d5”探针除了在“3d”探针中具有取代外还在“d”位置的位置3'处还具有额外的rna碱基。在成功活化ilock之后，此rna碱基将成为连接反应中的5'-磷酸供体末端。最后，我们设计了以末端3'和完整5'活瓣作为rna碱基(“3df”)的探针，以及其中仅5'活瓣由rna构成(“df”)(即缺少3'rna)的探针。
与非嵌合let-7ailock相比，ilock-3显著增加了let-7amirna的检测。根据连接的ilock探针的page(图4c)，在给定条件下，只有一小部分非嵌合ilock探针被活化(切割)，并且甚至更小部分被连接(图4c，泳道4)。几乎所有活化的ilock-3探针都已连接，如图4c(泳道5)中的定量凝胶位移以及ilock-3探针产生的rca产物总数(图4b)所证明。当由侵入的3'末端rna置换的活瓣核苷酸被rna取代时，如在ilock-3d中，观察到了额外的效率提高。大多数ilock-3d经活化并连接(图4c)。对于ilock-3df探针，观察到了类似的效果，其中整个5'活瓣序列是rna，而在不存在末端3'rna碱基的情况下失去了正效应(图4b)。有趣的是，活化后含有3'-(rn)/5'-(rn)的ilock-3d5探针示出比在(5)位置处具有脱氧核糖核苷酸的ilock探针显著更低的性能。对于使用pbcv-1和t4rnl2连接酶测试的其它mirna(mir21)，观察到ilock-3d探针的性能显著提高(图5)。类似地，在使用其它ilock-3d探针进行的重复实验中，对于pbcv-1和t4rnl2，使用let-7f作为模板也观察到了性能的提高(图27)。为了测试是否使用嵌合ilock-3d探针维持rna传感的准确度，我们使用四个嵌合ilock-3d探针靶向了四个多态性rna模板(表2)。嵌合ilock探针对匹配的rc/rg、ra/ru和ru/ra探针对表现出优异的保真度(图6)。当省略模板时，ilock-3d探针未显示连接产物。t4rnl2示出与ilockrna检测测定的完全相容性，从而容易连接靶标匹配的3'-oh(rn)/5'-p(n)ilock探针(图6b)。对于pbcv-1和t4rnl2，以相对较低的保真度检测到对rg/rc，从而示出rg/ru错连接分别为5％和27％(图6a、6b)。在另一个实验中，pbcv-1和t4rnl2均显示与ilockrna检测测定的完全相容性，从而容易连接靶标匹配的3'-oh(rn)/5'-p(n)ilock探针(图28a-b，图29，a-b)。对于两种酶，均以相对较低的保真度检测到rg/rc对，从而示出rg/ru错连接分别为21％和11％。因此，如从图28a-b可以看出，嵌合ilock比dnailock具有更好的性能。
使用嵌合ilock探针对let-7同种型的多重检测
高复用能力是锁式探针最有利的功能之一。源自不同锁式探针的扩增产物的区分典型地通过使用独特的探针特异性装饰寡核苷酸(标记有具有不同发射光谱的荧光团)来实现。可替代地，可以将独特的条形码序列嵌入到锁式探针主链中，所述锁式探针主链可以使用新一代连接测序化学方法解码。为了评估嵌合ilock探针与连接测序读出的相容性，我们重新设计了四个let-7家族ilock-3d探针，如方法部分(表3)中的所述。为了评估条形编码ilock-3d探针是否可以用于多重mirna分析，我们以四种不同的化学计量比组合了let-7f、let-7e、let-7dmirna。理想地，将在mirna特异性测序读段中准确反映比率。将ilock探针多重应用并且将扩增的产物固定在玻璃表面上。使用连接测序化学方法解码rcp的条形码。因为在此实验中仅使用了三个ilock探针，所以足以对第一条形码位置进行测序以解码检测到的mirna。ilock探针对mirna池示出类似的相对效率(图7)。在一种mirna浓度增加的样品中，对应的ilock探针的信号增加，而其它靶标的信号则保持稳定(图7c)。
实施例2–dna锁式探针和在其3'末端包含1或2个核糖核苷酸的嵌合探针的连接。
材料和方法
用1nm最终浓度的dna锁式探针或具有1或2个末端3'核糖核苷酸碱基的嵌合锁式探针，以及2nm最终浓度的合成krasrna模板或krasdna模板进行连接反应。寡核苷酸序列示于表6中。将反应在分别含有1u/μlrna酶抑制剂、0.2mg/mlbsa和1xsplintr缓冲液或t4rna连接酶ii缓冲液和0.25u/μl(低浓度)或1.25u/μl(高浓度)splintr连接酶，或0.2u/μl(低浓度)或1u/μl(高浓度)t4rna连接酶ii的连接缓冲液中以10μl的最终体积在37℃下温育30min。之后，如上文所述，在rca反应缓冲液中用滚环扩增来扩增环，最终环浓度为100pm。最后，rca产物用cy3标记的检测探针以10pm的最终浓度标记。对经标记的rca产物数位计数。
结果
对于splintr连接酶和t4rna连接酶ii两者，并且在rna模板和dna模板上，两种具有1个或2个末端3'核糖核苷酸碱基的嵌合锁式探针都产生比纯dna锁式探针更多的rca产物(图8)。增加的连接酶浓度对嵌合锁式探针没有任何影响，但对dna锁式探针有轻微的负面影响。具有1个或2个末端3'核糖核苷酸碱基的嵌合锁式探针之间的rca产物计数没有差异。
在rna模板上，splintr连接酶和t4rna连接酶ii的活性类似(图8a)。在dna模板上，对于splintr连接酶，dna锁式探针与嵌合锁式探针之间的差异与在rna模板上的差异类似，但针对使用t4rna连接酶ii在dna模板上连接嵌合锁式探针记录到rcp计数增加非常强劲(图8b)。t4rna连接酶ii在通过dna模板化时不接受3'dna和5'dna末端，但在通过dna模板化时容易接受具有3'rna末端的探针。
总之，使用嵌合探针使利用splintr连接酶和t4rna连接酶ii在rna模板上的连接反应比常规dna探针更有效。嵌合探针使t4rna连接酶ii可以用于dna模板上的连接反应。
实施例3–使用嵌合锁式探针和嵌合ilock探针的原位kras点突变检测
材料和方法
在补充有10％fbs2mml-谷氨酰胺和1x青霉素-链霉素(pest)的不含l-谷氨酰胺的rpmi培养基中培养onco-dg-1和a-427细胞系。在补充有10％fbs和1xpest的dmem中培养a-549。汇合时，将所有细胞系接种在superfrostplus载玻片上并且使其附着12h。然后将细胞在depc处理的pbs(depc-pbs)中的3％多聚甲醛中在室温下固定15min。在固定之后，将载玻片在depc-pbs中洗涤两次并且各自通过70％、85％和100％的乙醇系列脱水4min。将安全密封室安装在载玻片上，通过用pbs-t(具有0.05％tween20的depc-pbs)简单洗涤来水合细胞，然后在室温下用h2o中的0.1hcl透化1min。将细胞在depc-pbs-t中洗涤两次，并且然后将dna或嵌合探针以50nm的最终浓度添加到含有2xssc、20&甲酰胺和0.4u/μlrna酶抑制剂的杂交缓冲液中。寡核苷酸序列示于表6中。将探针在37℃下杂交60min。然后移除探针杂交混合物并且将细胞在含有2xssc和25％甲酰胺的预热(37℃)洗涤缓冲液中于37℃下洗涤15min，并且在含有2xssc和20％甲酰胺的预热(37℃)洗涤缓冲液中在37℃下洗涤一次，持续15分钟。将细胞在pbs-t中洗涤一次。然后将连接反应混合物添加到dna/嵌合锁式探针实验中(图9)并且将侵入反应混合物添加到dna/嵌合ilock实验中(图10)。连接反应混合物含有splintr连接酶缓冲液、0.2mg/mlbsa、0.8u/μlrna酶抑制剂和0.25u/μlsplintr连接酶。将连接反应在37℃下温育60min。侵入反应混合物含有的与连接反应相同并且含有额外的0.1u/μltaqdna聚合酶。将侵入反应混合物在37℃下温育60min。随后，所有实验反应都用pbs-t洗涤两次。将100nmrca引物在2xssc和20％甲酰胺杂交缓冲液中于室温下原位杂交30min。将细胞在pbs-t中洗涤两次。接着，添加含有1xphi29反应缓冲液、0.25mmdntp、0.2mg/mlbsa、1u/μlphi29聚合酶和5％甘油的rca反应混合物，并且在37℃下温育3小时。随后，将细胞在pbs-t中洗涤两次，并且将检测探针在2xssc和20％甲酰胺杂交缓冲液中与rca产物(cy3标记的探针与kras野生型探针，cy5标记的探针与kras突变探针)在室温下原位杂交30min。将细胞在pbs-t中洗涤三次，细胞核用dapi染色，再次洗涤三次，并且然后固定在slowfade固定培养基中。将细胞在荧光显微镜下以20x物镜成像并且使用cellprofiler软件对rca产物定量。
结果
与dna锁式探针相比，嵌合锁式探针对a549和oncodg1细胞系均具有更高的原位rna检测效率(图9b)。此外，相比于dna锁式探针，嵌合锁式探针在a549和oncodg1中每个细胞的特异性/非特异性rcp的比率均增加(在a549细胞(携带kras密码子12点突变)中检测到比野生型rcp更多的突变rcp，并且在oncodg1细胞(kras野生型)中检测到比突变rcp更多的野生型rcp)，这使得有可能使用嵌合探针直接在rna上更精确地原位检测点突变。
为了进一步提高点突变的特异性，我们原位应用了嵌合ilock探针，并且发现在oncodg1细胞中特异性检测到kras野生型mrna，并且在a549细胞中检测到kras密码子12点突变(图10)。
总之，嵌合探针显著提高原位rna检测效率，从而使原位rna分析比经典cdna方法更加灵敏、成本和时间效率更高。此外，与dna锁式探针相比，嵌合锁式探针，并且尤其是嵌合ilock探针示出更高的特异性，从而使原位rna分析更加有效和准确。
实施例4-缺口填充ilock探针
材料和方法
溶液内缺口填充ilock反应：
用10nm最终浓度的缺口填充ilock探针和30nm最终浓度的合成krasrna模板(或阴性对照中没有模板)进行连接反应。寡核苷酸序列示于表7中。将反应在含有1u/μlrna酶抑制剂、1u/μl逆转录酶、25μmdntp(或缺口填充阴性对照中无dntp)、0.2mg/mlbsa、1xsplintr连接酶缓冲液、0.1u/μltaqdna聚合酶和0.25u/μlsplintr连接酶的反应缓冲液中以10μl的最终体积在37℃下持续60min。之后，如上文所述，将环在pbs-t中稀释10倍(至1nm的理论浓度)并且然后在rca反应缓冲液中用滚环扩增来扩增，最终环浓度为100pm。最后，rca产物用cy3标记的检测探针以10pm的最终浓度标记并且数位计数。
原位缺口填充ilock反应
如实施例3中所述制备和处理oncodg1细胞。在与实施例3相同的条件下，以50nm浓度将缺口填充ilock探针与krasrna原位杂交。在洗涤之后，将缺口填充聚合侵入混合物添加至含有1u/μlrna酶抑制剂、10u/μl逆转录酶、25μmdntp(或缺口填充阴性对照中无dntp)、0.2mg/mlbsa、1xsplintr连接酶缓冲液、0.1u/μltaqdna聚合酶和0.25u/μlsplintr连接酶的细胞中并且在细胞上在37℃下温育60min。将细胞在pbs-t中洗涤两次。接着，添加含有1xphi29反应缓冲液、0.25mmdntp、0.2mg/mlbsa、1u/μlphi29聚合酶和5％甘油的rca反应混合物，并且在37℃下温育3小时。随后，将细胞在pbs-t中洗涤两次并且将cy3标记的检测探针与rca产物杂交，如上文所述。将细胞在pbs-t中洗涤三次，细胞核用dapi染色，再次洗涤三次，并且然后固定在slowfade固定培养基中。将细胞和rca产物在荧光显微镜下以20x物镜成像并且使用cellprofiler软件对rca产物定量。
结果
将溶液内缺口填充聚合-侵入反应的rca产物定量并绘制在图11a中。当存在rna模板时，对rca产物计数，表明该反应充分进行。当不存在模板(模板阴性)时，计数到显著较低的rcp数量，表明无法延伸缺口填充ilock探针，并且因此无法移除5'活瓣且无法连接至3'末端。
在存在rna模板但未添加dntp的对照反应中，与在阳性反应(具有模板和dntp)中相比，计数到显著较低的rcp数量，表明通过聚合和三链体形成的缺口填充受到限制，从而显著减少了活瓣的切割，因此产生较少的连接产物(图11a)。在原位反应中可见相同的趋势(图11b和c)。
实施例5-phi29作为逆转录酶的用途
材料和方法
寡核苷酸
寡核苷酸序列示于表8和表9中。如实施例1中所述提供探针。在合成的krasmrna模板上进行连接反应。锁式探针被设计成使得在rna杂交后，探针进行环化，从而在末端臂之间形成切口。为了方便地评估滚环产物(rcp)的尺寸，在连接探针臂(主链)的序列中嵌入报告序列。通过与报告序列杂交，将互补装饰物用于rcp染色。为了实时rca评估，将扩增的dna用sybrgold染料染色。
实时rca.为了评估rna碱基对phi29聚合酶的逆转录性能的影响，将20nm锁式探针与补充有4urna酶抑制剂(dnagdansk)、3.75u的pbcv-1dna连接酶(splintr，m0375s，neb)的10nmrna模板以15μl的最终体积混合。在37℃下将反应搅拌30min。连接后，将2μl连接体积(环)在含有1xphi29反应缓冲液(thermofisher)、125μmdntp(dnagdansk)、0.2mg/mlbsa(neb)和1×sybrgold(s11194，invitrogen)的18μlrca反应混合物中混合至2nm环的最终浓度。为了确保同时引发所有样品中的rca，将环放入试管盖中并且使用台式离心机将其旋成预先处置的主混合物。立即引发rca并且使用mx3005pqpcr系统(agilentgenomics)在37℃下检测sybrgold掺入持续60min，之后在65℃下phi29灭活2min。
为了研究是否可以通过添加逆转录酶来刺激富含rna的环的rca效率，向rca反应混合物中添加100u的rnaseh(-)transcriptme逆转录酶(dnagdansk)。
对从含有rna的环产生的rca产物的测序
单体化
为了对对应于环状模板内的rna碱基的rca产物内掺入的碱基进行测序，首先通过限制性内切消化使rca产物单体化。首先，将如上文所述的来自实时rca测量的rca产物在pbs-tween0.05％中稀释至100pm的浓度。接着，在含有1xphi29dna聚合酶缓冲液、2mg/mlbsa、100nm限制性寡核苷酸(aluikrasro-表9)、120mu/μlalui(neb)和10pm最终浓度的rca产物的反应混合物中在37℃下10min温育期间用alui限制性内切酶消化rca产物并且随后在65℃下热灭活2分钟。在完全消化10pmrca产物之后，rca单体浓度是大约10nm(80个碱基环的1小时rca产生约1000倍的扩增)。将rca单体在pbs-tween0.05％中稀释至100pm。
对rca单体的文库制剂测序
在pcr反应期间，首先用illumina接头序列标记rca单体，所述pcr反应含有1xtaqdna聚合酶缓冲液(neb)、1.5mmmgcl2(neb)、250μmdntp、1xsybrgold、25mu/μltaqdna聚合酶(neb)、0.5μm正向引物pe1(表9)、0.5μm反向引物pe2(表9)和最终浓度的10pmrca单体。pcr反应以95℃下的5min变性开始并且在95℃持续15秒、55℃持续30秒和70℃持续20秒之间循环20个循环。在qpcr仪器中监测反应并且在扩增达到饱和之前停止反应。在第一pcr步骤(延伸步骤)之后，将1μlpcr产物掺入到含有1xphusionhf缓冲液(thermoscientific)、0.2mmd(a,t,g,c)tp(thermoscientific)、1％dmso、250nm索引pcr引物(表11)中，每个样品都标记有7种不同正向引物之一和3种不同反向引物之一的独特组合)，并且在95℃下程序化初始2min，和95℃持续15秒、60℃持续1min和72℃持续1min的2个循环，以及72℃持续3min的额外循环。将索引的pcr产物稀释到含有1xphusionhf缓冲液(thermoscientific)、0.2mmd(a,t,g,c)tp(thermoscientific)、1％dmso、500nmp5和p7引物的pcr混合物中200倍，并且在95℃下程序化2min，以及95℃持续15秒、60℃持续30秒和72℃持续30秒的15个循环。合并pcr产物并且使用qiaquickpcr纯化试剂盒纯化，并且在
rcp大小和强度的形态学评估
为了测量rca产物大小和强度，将来自实时rca反应的rca产物稀释至20pm的最终浓度，在标准杂交条件下用5nm最终装饰探针浓度标记。将10μl荧光标记的rca产物施加到superfrost玻璃载玻片(thermofisher)上，通过20x20mm盖玻片(menzel)铺开并且在15分钟温育期间使其静电结合到带正电的表面上。移除盖玻片，将载玻片在pbs中短暂洗涤，固定在固定培养基中，并且在zeissaxioplan荧光显微镜上在cy3通道中以20倍放大成像。将图像导出为原始的黑白(bw)图片并且使用cellprofiler软件处理。简言之，使用自动高帽滤波预处理每个图像。使用手动调整的阈值鉴别对象并且基于对象强度分离。记录平均荧光强度和对象大小，导出为csv文件并在r！studio中处理。
结果
phi29dna聚合酶接受嵌合环作为滚环扩增(rca)模板
我们已经观察到，含有rna和dna核苷酸的环状嵌合锁式探针可以用作rca的底物，表明phi29dna聚合酶具有逆转录酶活性。为了研究此活性，我们已经环化了在dna探针主链中含有1-7个rna取代的各种rna/dna嵌合锁式探针并且在rca期间将环化的探针用作模板(图13)。
通过sybrgold掺入实时监测rca反应。另外，对rca产物数位计数并且评估其大小和强度(即形态学)。
我们观察到pbcv-1容易密封纯dna探针和嵌合的3'-(rn)/5'(n)探针切口，并且phi29聚合酶接受纯的含dna和rna的环作为rca的模板(图13a)。来自3'rna探针的较高数量的rca产物很可能是由于嵌合探针的连接效率提高，如实施例1中所详述。当在连接反应期间未添加模板时，探针未被连接并且无法扩增(图13a，靶标-)。
接着，我们旨在研究在没有连接反应偏差的情况下嵌合dna/rna环的rca效率。为此，我们在不参与连接反应的环主链中添加了rna取代。因此，所有探针都含有相同的靶标互补dna探针臂序列(有助于形成连接底物)并且被连接到相同的rna靶标上。然后，我们通过对rca产物计数(图13b)并且实时监测扩增反应(图13c)来研究了增加数量的rna取代如何影响rca反应效率。使用作为dna探针的具有序列seqidno:119、120、124、131、110、111和112的锁式探针和具有0、1、2、3、4、5和7个连续核糖核苷酸的嵌合探针。
当在探针(环)主链中取代单一rna时，我们没有观察到对rca效率的影响(图13b和13c，图32a和32b)。当环被2个连续rna核苷酸取代时，观察到了对rca的强烈抑制(大约90％)(图13b和13c，图32a和32b)。对于具有超过2个rna取代的环，未检测到扩增(图13e，图32c)。当使用落射荧光显微镜对滚环产物(rcp)成像时，具有2个连续rna取代基的环的rcp的平均大小和强度降低(图13d)。超过两个连续的rna取代(3-7)导致rca的完全抑制并且在这些样品中未检测到rcp。
我们另外研究了是否可以通过在rca反应期间供应m-mulv逆转录酶来恢复富含rna的环的rca。然而，在使用的反应条件下，rca活性在存在逆转录酶的情况下未恢复。相比之下，与无额外逆转录酶的rca反应相比，通过添加m-mulv逆转录酶(曲线的下图)来显著降低扩增速率(图19)。
phi29dna聚合酶在rca期间优先逆转录rna嘧啶
在先前的实验中，环主链中的dna碱基越来越多地被rna碱基取代。针对具有rgra和rgrarc取代的环观察到了强烈的扩增抑制。为了研究含rna的环的rca效率是否存在序列依赖性，我们使用具有单个ru/ra/rc/rgrna碱基以及二核苷酸和三核苷酸长同源核苷酸段的环实时监测rca速率(表9)。我们针对所有单一rna取代观察到了有效rca(图18a)。对于二核苷酸rna取代，我们观察到rcrc环的rca速率最高，之后是ruru环，而rara和rgrg环受到显著抑制。对于三核苷酸rna环，仅rcrcrc环产生可检测的rca，但是其速度显著慢于含有rcrc的环(图18a)。许多核糖核苷酸探针seqidno:108-112、124-127、131-134、137和139含有其它异核苷酸核糖核苷酸序列。使用不具有额外核糖核苷酸段的探针seqidno:267-281(表13)重复实验并且观察到类似的结果(图24-25)。
为了研究是否可以恢复较长混合的rna/dna段的rca，我们分别在3个和6个rna碱基的段中插入1个和2个dna碱基(图18b)。扩增了在主链中含有rgarcgru序列的环，而对于具有6个插入的rna取代的环，或具有5个和7个连续rna碱基的环，则未检测到rca(图18b)。
锰离子增加phi29dna聚合酶的rna依赖性rca活性
因为某些dna依赖性dna聚合酶在存在mn2 的情况下能够逆转录rna，所以我们在mg2 和mn2 存在下比较了phi29dna聚合酶rca速率。使用mn2 作为辅因子，除了rc以外，phi29dna聚合酶还有效扩增了单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸ru和ra段(图24)。有趣的是，与单一rna取代的环相比，rcrc、ruru和rara环的扩增速率更高，对于以mg2 为辅因子的rcrc也是这样(图24a，b)。为了研究如果将多个rna碱基与dna碱基混合是否可以恢复rca，使用mg2 和mn2 扩增了多个嵌合构建体(图25)。根据我们的观察，当将rna碱基插入dna中时，phi29dna聚合酶能够参与有效的mn2 依赖性rca(图25，表12)。有趣的是，当以均匀分散的模式组织取代时，具有多达8个rna碱基的环状嵌合底物得到以充分扩增(图25)。
对滚环产物测序证明phi29dna聚合酶逆转录rna的能力
因为phi29聚合酶的扩增速率与底物中rna碱基的数量成反比，所以我们认为该酶可能在rca期间忽略rna位置，从而在扩增产物中引入单核苷酸或双核苷酸缺失。为了验证此假设，如前所述，扩增含有单和双rna取代(rar/ur/g/rc/rara/ruru/rgrg/rcrc，表9)的环并且实时监测rca速率。扩增后，由不同扩增产物制备测序文库，并且然后使用illumina
根据我们的观察，phi29dna聚合酶在其中模板序列是rna的扩增rcp中掺入了预期的dna核苷酸。对于不含rna取代的环，>99％的测序单体示出在r1锁式探针区域处正确掺入的碱基(此处称为准确度)，其在图20中突出显示(99.68％，dna锁式探针的位置r1的rt准确度)。当r1位置被ra、rc、rg或ru取代时，rt准确度分别是99.88％、99.70％、96.07％、99.88％。尽管以比测序更好的准确度拷贝ra、rc和ru的，或者在研究位置中至少不比dg差，但rg以更高的复制误差突出。有趣的是，不仅针对r1位置，而且针对锁式探针主链中的所有后续胞嘧啶碱基都观察到了此更高的掺入误差。当r1和r2位置均被rara、rcrc、rgrg和ruru取代时，r1/r2位点的rt准确度分别是99.81/99.59％、99.82/99.86％、93.01/89.7％和99.93/99.94％。类似于在r1中具有单个rg取代的环，所有二核苷酸rna底物都显示出对整个探针主链序列中的非rna胞嘧啶更高的误差率。
在另一个实验中，当r1位置被ra、rc、rg或ru取代时，平均误差率分别是0.111％、0.153％、2.259％和0.084％(图30、图31、图33)。尽管以与dna相同的准确度拷贝ra、rc和ru(如通过测序测量)，但rg以更高的复制误差突出。有趣的是，不仅针对r1位置，而且针对锁式探针主链中的所有鸟苷碱基观察到较高的掺入误差(在图31和图33中均以高误差率峰可见)，并且针对图30中的rg锁式探针标志图观察到较高的胸腺嘧啶频率。当r1和r2位置均被rara、rcrc、rgrg和ruru取代时，r1/r2位点的误差率分别是0.269/0.561％、0.107/0.109％、2.827/2.231％和0.144/0.220％。类似于在r1中具有单个rg取代的环，所有二核苷酸rna底物都显示出对整个探针主链序列中的非rna鸟苷更高的误差率(图3c)。
我们证明了phi29dna聚合酶有限的逆转录活性。我们证实了环状模板中的单一rna取代基对rca效率没有影响。然而，我们已经发现，当在环状模板序列中取代更多连续的rna碱基时，扩增被抑制。为了表征phi29聚合酶的这种新颖活性，我们用phi29聚合酶扩增了含有一个、两个或三个连续rna碱基ra、rg、rc或ru的环状模板并且实时监测rca速率。此外，我们测试了不同rna碱基与间隔rna碱基和dna碱基的各种组合。我们的数据证明偏好含有嘧啶rna碱基的环状底物，因为具有3个连续嘧啶碱基的环仍可以被扩增，但具有3个连续嘌呤碱基的环不能被扩增。有趣的是，用dna碱基取代3个rna的间隔环导致rca效率的部分恢复，从而表明含rna的环的rca受限于单一rna碱基取代或极短的连续rna碱基段。通过添加逆转录酶来提高含有较长rna碱基段的环的rca效率的尝试失败。取而代之的是，rca在存在专用逆转录酶的情况下被抑制，这可能是由于阻断了环状底物与phi29dna聚合酶结合。
我们的数据清楚表明，聚合酶拷贝含有rna的环的机制是逆转录，因为我们发现匹配的dna碱基以高频率(ra、ru和rc是>99％，rg是约96％)掺入到rca产品中。rna取代基的总体掺入准确度与纯dna取代基的准确度没有区别。
实施例6-使用嵌合探针原位检测mrna
材料和方法
将bjhtert和mef细胞在由杜氏改良伊格尔培养基(dmem；invitrogen)、10％胎牛血清(sigma)和1％青霉素-链霉素混合物(pest；gibco)组成的生长培养基中培养。在存在5％co2的情况下将两种细胞系在37℃下在潮湿细胞培养箱中生长。在实验之前，使用胰蛋白酶-edta0.25％溶液(t4049sigma)将细胞从培养瓶中移出，并且在具有5个浸没的显微镜载玻片的150-mm细胞培养皿中培养过夜。将具有附着细胞的载玻片用pbs洗涤两次，在冰上用含3.4％甲醛的新鲜制备的焦碳酸二乙酯(depc)处理的pbs中固定15min。此后，将载玻片用depc-pbs洗涤两次，以乙醇梯度脱水(70％、85％和99％；各3分钟)，风干，并且在80℃下存储。在实验当天，将细胞解冻，干燥，并且针对每种测试条件，通过覆盖8mm直径和50ul体积的安全密封室(invitrogen)来分离。用depc-tbs缓冲液将细胞再水合。每个温育步骤之后是两次depc-pbs-t洗涤((depc)处理的pbs，含有0.05％tween20作为表面活性剂)。所有温育都在潮湿室中进行以避免反应混合物蒸发。
合并两种actb转录物的探针(表4)，并且以最终浓度0.1μm在杂交缓冲液(ph8下的475mmtris-hcl；示于4中的0.95mmedta，760mmnacl.0.8u/μlrna抑制剂(dnagdansk))中以50ul反应体积在37℃下预杂交(池1：非嵌合plp，池2：嵌合plp，池3：ilock，池4：嵌合ilock)2小时。通过使用预热(37℃)的tbs-tween缓冲液严格洗涤两次来将未杂交的探针移除。通过在depc-ddh2o中添加0.5u/μlsplintr连接酶(neb)、1xsplintr缓冲液、0.8u/μlrna酶抑制剂进行连接反应。通过以最终浓度0.1u/μl同时添加taqdna聚合酶来进行ilock连接和活化(对于ilock探针)。将载玻片在37℃下温育2小时并且用depc-pbs-t洗涤两次。
通过添加1u/μlphi29dna聚合酶(monserate)、1xphi29dna聚合酶缓冲液、0.25mmdntp(thermoscientific)、0.2μg/μlbsa(neb)、5％甘油和depc-ddh2o以50μl最终反应体积在37℃下进行滚环扩增反应持续6小时并且用depc-pbs-t洗涤两次。
最后，将装饰寡核苷酸与具有hoechst33342(thermoscientific)的杂交缓冲液(2xssc，20％甲酰胺，ddh2o)中0.1μm最终浓度下的rca产物在depc-pbs中在室温下杂交30分钟。细胞用depc-pbs-t洗涤两次，通过乙醇系列(70、85和99.5％乙醇，各3min)脱水，并且盖玻片用slow-fade培养基(thermoscientific)固定。使用cellprofiler软件对细胞中的信号定量并且在r！中分析。
结果
尽管将探针合并在一起，但在细胞中仅观察到预期的信号(图21a)。此外，与非嵌合锁式探针相比时，嵌合锁式探针更有效地起作用(产生更多可检测的rca产物)。与常规锁式探针相比时，ilock探针产生显著更少的信号，这表明需要进一步优化方案以确保有效的探针活化和原位rna检测。然而，数据分析揭示，针对嵌合和非嵌合ilock探针也观察到预期的信号，并且嵌合ilock探针的信号也更高(图21b)。
实施例7-使用dnaplp、嵌合plp以及dna和嵌合ilock探针在固体支持物上检测mir21。
在此实施例中，将mir21固定在载玻片表面上并且原位检测。用16xru接头从靶序列中分离出5'生物素部分，制备mir21。用常规和嵌合锁式探针以及非嵌合和嵌合ilock探针检测mir21。靶序列和探针序列示于表5中。
材料和方法
将8mm直径和50ul体积的安全密封室(invitrogen)放在中性生物素涂布的显微镜载玻片(polyan)上。总共使用六个安全密封硅酮室。将mir21靶标(mir21_bio)在于室温下温育的1x标记溶液(2xssc，20％甲酰胺)中稀释至50nm最终浓度，轻微摇晃1小时。在一种情况下，有意省略了mir21靶标(阴性对照)。在将mir21固定之后，将腔室用pbs-tween20(0.05％)洗涤3次。将其中没有发生连接或活化的腔室(涂布对照)保持在pbs中直至实验结束。
使锁式探针、ilock探针和“涂布对照”探针(抗mir21_fam)与固定靶标在最终浓度10pm(锁式探针和ilock探针)或50nm(对于抗mir21_fam探针)下杂交。将探针在杂交缓冲液(ph8下的475mmtris-hcl；0.95mmedta，760mmnacl)中于45℃下杂交15分钟并且在室温下轻轻摇晃3小时。然后将腔室用pbs-tween20(0.05％)洗涤2次。
通过在depc-ddh2o中添加0.5u/ulsplintr连接酶(neb)、1xsplintr缓冲液进行连接反应。通过以最终浓度0.1u/ul同时添加taqdna聚合酶来进行ilock连接和活化(对于ilock探针)。将载玻片在37℃下温育1小时并且用depc-pbs-t洗涤两次。
通过添加0.5u/μlphi29dna聚合酶(monserate)、1xphi29dna聚合酶缓冲液、0.125mmdntp(thermoscientific)、0.2μg/μlbsa(neb)、5％甘油和depc-ddh2o以50μl最终反应体积在室温下进行滚环扩增反应持续3小时并且用depc-pbs-t洗涤两次。
最后，将装饰寡核苷酸与杂交缓冲液(2xssc，20％甲酰胺，ddh2o)中0.1μm最终浓度下的rca产物在depc-pbs中在室温下杂交1小时。细胞用depc-pbs-t洗涤两次，在99％乙醇中脱水3min，并且盖玻片用slow-fade培养基(thermoscientific)固定。使用cellprofiler软件对细胞中的信号定量。
结果
我们的数据表明，当未固定mir21时，因为未从标记的互补探针中检测到荧光，所以将生物素化的mirna靶标有效固定在中性生物素涂布的显微镜载玻片上。检测结果示于图22b中。传统的锁式探针产生约7800个rca产物(rcp)/视场(fov)，而当使用嵌合锁式探针时定量约36000个rcp/fov。与在bjhtert和mef培养的细胞中检测到actbmrna的实施例一致，与锁式探针相比，ilock探针产生更少的信号。嵌合ilock探针产生约3000个rcp/fov，而未经修饰的ilock探针仅产生约195个rcp/fov。
实施例8-在小鼠脑组织切片中使用嵌合锁式探针进行原位多重基因表达谱分析和细胞类型分析以及原位测序
材料和方法
紧接在手术切除之后且在没有任何固定的情况下将p30小鼠大脑嵌入到oct培养基中并且直接在干冰上冷冻，并且此后在-80℃下存储直至使用。然后用低温恒温器切割10μm切片并且将切片收集在superfrost玻璃载玻片上。然后将切片在室温下在depc处理的pbs中的3.7％pfa中短暂固定5min。之后，将切片在0.05％depc-pbstween中洗涤一次并且在室温下用0.1mhcl透化5min。在透化之后，将载玻片在depc-pbs中洗涤两次并且各自通过70％、85％和100％的乙醇系列脱水2min。将安全密封室安装在覆盖组织切片的载玻片上，并且通过用pbs-t(含0.05％tween的depc-pbs)短暂洗涤将组织水合。为了用嵌合锁式探针(plp)靶向mrna，在短暂再水合洗涤之后，将切片浸入含有2xssc缓冲液、20％甲酰胺、0.05mkcl、0.2mg/mlbsa、1u/μlrna酶抑制剂和50nm嵌合plp的嵌合plp杂交混合物中。在45℃下进行杂交过夜。之后，将切片在预热的缓冲液(2xssc，20％甲酰胺)中于37℃下洗涤15min。最后，将切片在pbs-t中洗涤2次。然后将连接反应混合物添加到该切片中，所述连接反应混合物含有1xsplintr连接酶缓冲液、0.2mg/mlbsa、0.8u/μlrna酶抑制剂和0.25u/μlsplintr连接酶。将连接反应在37℃下温育60min。将切片在pbs-t中洗涤两次。接着，将切片浸入滚环扩增混合物中，所述滚环扩增混合物含有1xphi29聚合酶缓冲液、0.25mmdntp、0.2mg/mlbsa、1u/μlphi29聚合酶、5％甘油和50nmrca引物。将rca在37℃下进行3h。随后，将切片在pbs-t中洗涤两次并且使检测探针(在原位测序反应中充当锚定探针)在2xssc和20％甲酰胺杂交缓冲液中于室温下与rca产物原位杂交30min。
对于原位测序，如先前在ke等人(2013，naturemethods)中所述，将切片浸入连接测序混合物，所述连接混合物含有1xt4连接缓冲液、1mmatp、0.2mg/mlbsa、0.1u/μlt4dna连接酶和100nm每种测序文库碱基1(用于测序第一条形码位置，用于测序第2条形码位置的测序文库碱基2等)。将测序反应在室温下温育1h。然后将切片在pbs-t中洗涤3次并且细胞核用dapi染色，再次洗涤三次，如上文所述进行短乙醇系列，并且然后将组织固定在slowfade固定培养基中。然后将组织切片在荧光显微镜中以20倍物镜成像。为了测序第2碱基，首先在乙醇中洗涤切片以移除固定培养基，然后在100％甲酰胺中洗涤2次以剥离锚定探针和连接的测序探针。将切片在pbs-t中洗涤3次并且然后将用于第二碱基的连接测序混合物(与上文相同的组成)添加到切片中并且针对第3和第4位置重复该程序。测序反应的图像然后通过cellprofiler软件和matlab脚本处理，如先前在ke等人(natmethods2013)中所述。
结果
由于cdna合成效率低，使用cdna合成进行多重原位基因表达谱分析以及随后通过dna锁式探针(plp)靶向cdna通常受限于高表达基因。迄今为止用plp直接靶向rna是困难的，这是由于酶对rna的探针连接效率低以及特异性不足导致假阳性信号。在此实验中，我们证实了嵌合plp对rna非常有效的连接(图23)。我们在小鼠脑组织切片上应用了靶向18种不同基因的嵌合plp，每种基因5个探针(总共90个探针)(表10)。用稍后可以通过原位测序解码的测序条形码对探针进行条形编码。首先使探针与rna杂交并且然后在洗涤之后使用splintr连接酶连接探针。使用t4rna连接酶2可以进一步提高特异性，因为我们已经证实在使用t4rna连接酶2下特异性和效率提高(参见先前实施例)。连接探针用rca扩增并且rca产物中的条形码通过连接化学方法测序来测序，如先前在ke等人(natmethods2013)中所述。使用嵌合plp的直接rna方法获得的总体表达模式与通过传统cdna靶向方法获得的总体表达模式非常相当(数据未示出)。为简单起见，在此实施例中呈现了所有rca产品的一般染色。嵌合plp直接rna方法除了高灵敏度的优势之外，测定成本较低，因为cdna合成步骤与逆转录酶的高成本相关，并且测定可以更快地进行，因为省略了cdna合成步骤。总体而言，嵌合探针示出了在组织切片中与原位测序读出组合进行高度多重rna分析的潜力。
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aaaaaaaaaactatacaac79
<210>35
<211>25
<212>rna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>benchm_templ_c
<400>35
ucucgcugucaucccuauauccucg25
<210>36
<211>25
<212>rna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>benchm_templ_a
<400>36
ucucgcugucauaccuauauccucg25
<210>37
<211>25
<212>rna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>benchm_templ_g
<400>37
ucucgcugucaugccuauauccucg25
<210>38
<211>25
<212>rna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>benchm_templ_u
<400>38
ucucgcugucauuccuauauccucg25
<210>39
<211>79
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
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<400>39
tatatccctatattatgacagcgagaaaaaaaaaaaagtagccgtgactatcgactaaaa60
aaaaaacgaggatataggt79
<210>40
<211>79
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>3'g_ilock_3
<400>40
tatatccctatatgatgacagcgagaaaaaaaaaaaagtagccgtgactatcgactaaaa60
aaaaaacgaggatataggg79
<210>41
<211>79
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>3'a_ilock_3
<400>41
tatatccctatataatgacagcgagaaaaaaaaaaaagtagccgtgactatcgactaaaa60
aaaaaacgaggatatagga79
<210>42
<211>79
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>3'c_ilock_3
<400>42
tatatccctatatcatgacagcgagaaaaaaaaaaaagtagccgtgactatcgactaaaa60
aaaaaacgaggatataggc79
<210>43
<211>79
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>3'u_ilock_rna_3
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(79)..(79)
<223>rna
<400>43
tatatccctatatuatgacagcgagaaaaaaaaaaaagtagccgtgactatcgactaaaa60
aaaaaacgaggatataggu79
<210>44
<211>79
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>3'g_ilock_rna_3
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(79)..(79)
<223>rna
<400>44
tatatccctatatgatgacagcgagaaaaaaaaaaaagtagccgtgactatcgactaaaa60
aaaaaacgaggatataggg79
<210>45
<211>79
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>3'a_ilock_rna_3
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(79)..(79)
<223>rna
<400>45
tatatccctatataatgacagcgagaaaaaaaaaaaagtagccgtgactatcgactaaaa60
aaaaaacgaggatatagga79
<210>46
<211>79
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>3'c_ilock_rna_3
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<220>
<221>misc_feature
<222>(79)..(79)
<400>46
tatatccctatatcatgacagcgagaaaaaaaaaaaagtagccgtgactatcgactaaaa60
aaaaaacgaggatataggc79
<210>47
<211>24
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>装饰探针_1
<400>47
cctcaatgcacatgtttggctcca24
<210>48
<211>21
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>装饰探针_2
<400>48
tgcgtctatttagtggagcca21
<210>49
<211>21
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>装饰探针_3
<400>49
agtagccgtgactatcgacta21
<210>50
<211>22
<212>rna
<213>智人（homosapiens）
<400>50
ugagguaguagguuguauaguu22
<210>51
<211>22
<212>rna
<213>智人（homosapiens）
<400>51
ugagguaguagauuguauaguu22
<210>52
<211>22
<212>rna
<213>智人（homosapiens）
<400>52
ugagguaggagguuguauaguu22
<210>53
<211>22
<212>rna
<213>智人（homosapiens）
<400>53
agagguaguagguugcauaguu22
<210>54
<211>69
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>let-7a_seqrna
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(69)..(69)
<223>rna
<400>54
aaagatgcgatacactacctcatgcgtctatttagtggagcccgctatcttctttaacta60
tacaaccta69
<210>55
<211>69
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>let-7e_seqrna
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(69)..(69)
<223>rna
<400>55
aaaatgtcgttgccctcctacctcatgcgtctatttagtggagccgcctatcttctttaa60
ctatacaac69
<210>56
<211>69
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>let-7d_seqrna
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(69)..(69)
<223>rna
<400>56
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ctatgcaac69
<210>57
<211>69
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>let-7f_seqrna
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(69)..(69)
<223>rna
<400>57
aaaatgtcgttgcuctactacctcatgcgtctatttagtggagcctactatcttctttaa60
ctatacaau69
<210>58
<211>69
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>let-7a_seq
<400>58
aaagatgcgatacactacctcatgcgtctatttagtggagcccgctatcttctttaacta60
tacaaccta69
<210>59
<211>69
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>let-7e_seq
<400>59
aaaatgtcgttgccctcctacctcatgcgtctatttagtggagccgcctatcttctttaa60
ctatacaac69
<210>60
<211>69
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>let-7d_seq
<400>60
aaaatgtcgttgccctactacctcttgcgtctatttagtggagccatctatcttctttaa60
ctatgcaac69
<210>61
<211>69
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>let-7f_seq
<400>61
aaaatgtcgttgctctactacctcatgcgtctatttagtggagcctactatcttctttaa60
ctatacaat69
<210>62
<211>21
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>装饰探针
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'cy3
<400>62
tgcgtctatttagtggagcca21
<210>63
<211>21
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>锚定引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'alexafluor750
<400>63
tgcgtctatttagtggagcca21
<210>64
<211>9
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>seqlibb1t
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'磷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(9)
<223>n为任意核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>3'fitcb
<400>64
tnnnnnnnn9
<210>65
<211>9
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>seqlibb1g
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'磷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(9)
<223>n为任意核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>3'cy3b
<400>65
gnnnnnnnn9
<210>66
<211>9
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>seqlibb1a
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'磷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(9)
<223>n为任意核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>3'cy5b
<400>66
annnnnnnn9
<210>67
<211>9
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>seqlibb1c
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'磷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(9)
<223>n为任意核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>3'texasredb
<400>67
cnnnnnnnn9
<210>68
<211>54
<212>dna
<213>小家鼠（musmusculus）
<400>68
ggcctgtacactgacttgagaccaataaaagtgcacaccttaccttacacaaac54
<210>69
<211>94
<212>dna
<213>智人（homosapiens）
<400>69
tacctgtacactgacttgagaccagttgaataaaagtgcacaccttaaaaatgaaaaaaa60
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa94
<210>70
<211>69
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>小鼠plp
<400>70
taaggtgtgcaaaaagtagccgtgactatcgactaaaagtagccgtgactatcgactgtt60
tgtgtaagg69
<210>71
<211>68
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>人类plp
<400>71
taaggtgtgcaagtcggaagtactactctctaaaagtcggaagtactactctcttttttt60
ttcatttt68
<210>72
<211>69
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>小鼠cplp
<220>
<221>misc_feature
<222>(69)..(69)
<223>rna
<400>72
taaggtgtgcaaaaagtagccgtgactatcgactaaaagtagccgtgactatcgactgtt60
tgtgtaagg69
<210>73
<211>68
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>人类cplp
<220>
<221>misc_feature
<222>(68)..(68)
<223>rna
<400>73
taaggtgtgcaagtcggaagtactactctctaaaagtcggaagtactactctcttttttt60
ttcatttu68
<210>74
<211>83
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>小鼠ilock
<400>74
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gactatcgactgtttgtgtaagg83
<210>75
<211>82
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>人类ilock
<400>75
tatatccctatatttaaggtgtgcaagtcggaagtactactctctaaaagtcggaagtac60
tactctctttttttttcatttt82
<210>76
<211>83
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>小鼠cilock
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(83)..(83)
<223>rna
<400>76
tatatccctatatgtaaggtgtgcaaaaagtagccgtgactatcgactaaaagtagccgt60
gactatcgactgtttgtgtaagg83
<210>77
<211>82
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>人类cilock
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(82)..(82)
<223>rna
<400>77
tatatccctatatutaaggtgtgcaagtcggaagtactactctctaaaagtcggaagtac60
tactctctttttttttcatttu82
<210>78
<211>37
<212>rna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>mir21_bio
<400>78
uuuuuuuuuuuuuuuuagcuuaucagacugauguuga37
<210>79
<211>55
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>>mir21b2do_plp
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'磷酸
<400>79
ctgataagctagccgaatctaagagtagccgtgactatcgactaaaactacacca55
<210>80
<211>68
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>>mir21b2do_ilock
<400>80
ccgtcgctgcgttctgataagctaaaaaaaagtagccgtgactatcgactaaaaaaatca60
acatcagt68
<210>81
<211>66
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>>mir21b2do_rplp
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'磷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>磷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(66)..(66)
<223>rna
<400>81
ctgataagctagccgaatctaagagtagccgtgactatcgactaaaactacaccatcaac60
atcagu66
<210>82
<211>68
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>>mir21b2do_rilock
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(68)..(68)
<223>rna
<400>82
ccgtcgctgcgtuctgataagctaaaaaaaagtagccgtgactatcgactaaaaaaatca60
acatcagu68
<210>83
<211>20
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>>b2do_cy3
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'cy3
<400>83
agtagccgtgactatcgact20
<210>84
<211>22
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>>antimir21_fam
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'fam
<400>84
tcaacatcagtctgataagcta22
<210>85
<211>99
<212>dna
<213>智人（homosapiens）
<400>85
acattttcattatttttattataaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggta60
gttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgata99
<210>86
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>wtkrasplp
<400>86
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcagacgtaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>87
<211>41
<212>rna
<213>智人（homosapiens）
<400>87
aacuugugguaguuggagcugguggcguaggcaagagugcc41
<210>88
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>chimwtkrasplp
<220>
<221>misc_feature
<222>(77)..(77)
<223>rna
<400>88
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcagacgtaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>89
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>chimwtkrasplp_2
<220>
<221>misc_feature
<222>(76)..(77)
<223>rna
<400>89
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcagacgtaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>90
<211>80
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>mutkrasplp
<400>90
agctccaactaccacaacctcaatgcacatgtttggctcccagacgtaacgcgttcagtg60
atgcccttgcctacgccact80
<210>91
<211>80
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>chimmutkrasplp
<220>
<221>misc_feature
<222>(80)..(80)
<223>rna
<400>91
agctccaactaccacaacctcaatgcacatgtttggctcccagacgtaacgcgttcagtg60
atgcccttgcctacgccacu80
<210>92
<211>15
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>rca引物
<400>92
catcactgaacgcgt15
<210>93
<211>23
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>mutdo-cy5
<400>93
cctcaatgcacatgtttggctcc23
<210>94
<211>20
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>wtdo-cy3
<400>94
agtcgatagtcacggctact20
<210>95
<211>91
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>kraswt侵入chim3-5
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(91)..(91)
<223>rna
<400>95
tatatccctatatcagctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcagacgtaa60
cgcgttcagtgatgcccttgcctacgccacc91
<210>96
<211>91
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>kraswt侵入chim3
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(91)..(91)
<223>rna
<400>96
tatatccctatatcagctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcagacgtaa60
cgcgttcagtgatgcccttgcctacgccacc91
<210>97
<211>94
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>krasmut侵入chim3-5
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(94)..(94)
<223>rna
<400>97
tatatccctatatuagctccaactaccacaacctcaatgcacatgtttggctcccagacg60
taacgcgttcagtgatgcccttgcctacgccacu94
<210>98
<211>94
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>krasmut侵入chim3
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(94)..(94)
<223>rna
<400>98
tatatccctatattagctccaactaccacaacctcaatgcacatgtttggctcccagacg60
taacgcgttcagtgatgcccttgcctacgccacu94
<210>99
<211>94
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>kras缺口填充侵入物
<400>99
tatatctctatatagctccaactaccacaagtagtcgatagtcacggctactcagacgta60
acgcgttcagtgatgagtaggcactcttgcctac94
<210>100
<211>19
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>侵入物_夹板_chim
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(19)
<223>rna
<400>100
tatatctctatatgccacc19
<210>101
<211>19
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>侵入物_夹板
<400>101
tatatctctatatgccacc19
<210>102
<211>6
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>夹板
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>rna
<400>102
gccacc6
<210>103
<211>6
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>夹板_chim
<400>103
gccacc6
<210>104
<211>15
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>rca引物
<400>104
catcactgaacgcgt15
<210>105
<211>20
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>do-cy3
<400>105
agtcgatagtcacggctact20
<210>106
<211>41
<212>rna
<213>智人（homosapiens）
<400>106
aacuugugguaguuggagcugguggcguaggcaagagugcc41
<210>107
<211>57
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kraswt1_1
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>rna
<400>107
agctccaactaccacaacagacgtaacgcgttcagtgatgcccttgcctacgccacc57
<210>108
<211>57
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kraswt1_2
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(21)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(30)
<223>rna
<400>108
agctccaactaccacaacagacgtaacgcgttcagtgatgcccttgcctacgccacc57
<210>109
<211>57
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kraswt1_3
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(22)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(30)
<223>rna
<400>109
agctccaactaccacaacagacgtaacgcgttcagtgatgcccttgcctacgccacc57
<210>110
<211>57
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kraswt1_4
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(23)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(30)
<223>rna
<400>110
agctccaactaccacaacagacgtaacgcgttcagtgatgcccttgcctacgccacc57
<210>111
<211>57
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kraswt1_5
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(24)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(30)
<223>rna
<400>111
agctccaactaccacaacagacguaacgcgttcagtgatgcccttgcctacgccacc57
<210>112
<211>57
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kraswt1_7
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(26)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(30)
<223>rna
<400>112
agctccaactaccacaacagacguaacgcgttcagtgatgcccttgcctacgccacc57
<210>113
<211>57
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kraswt1_6s
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(21)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(28)..(29)
<223>rna
<400>113
agctccaactaccacaacagacguaacgcgttcagtgatgcccttgcctacgccacc57
<210>114
<211>50
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kraswt1_dna
<400>114
agctccaactaccacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacttgcctacgccacc50
<210>115
<211>50
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kraswt1_rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(50)..(50)
<223>rna
<400>115
agctccaactaccacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacttgcctacgccacc50
<210>116
<211>22
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>装饰探针[1]
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(22)
<223>2'o-merna
<400>116
cctcaatgcacatgtttggctc22
<210>117
<211>20
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>装饰探针2[2]
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(20)
<223>2'o-merna
<400>117
agtcgatagtcacggctact20
<210>118
<211>41
<212>rna
<213>智人（homosapiens）
<400>118
aacuugugguaguuggagcugguggcguaggcaagagugcc41
<210>119
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.0
<400>119
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcagacgtaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>120
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.1g
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(40)
<223>rna
<400>120
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcagacgtaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>121
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.1c
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(40)
<223>rna
<400>121
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcacacgtaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>122
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.1a
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(40)
<223>rna
<400>122
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcaaacgtaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>123
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.1u
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(40)
<223>rna
<400>123
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcauacgtaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>124
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.2g
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(41)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(50)
<223>rna
<400>124
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcaggcgtaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>125
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.2c
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(41)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(50)
<223>rna
<400>125
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcacccgtaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>126
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.2a
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(41)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(50)
<223>rna
<400>126
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcaaacgtaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>127
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.2u
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(41)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(50)
<223>rna
<400>127
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcauucgtaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>128
<211>18
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>aluikrasro
<400>128
cgccaccagctccaacta18
<210>129
<211>53
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>pe1
<400>129
acactctttccctacacgacgctcttccgatctctggtggcgtaggcaagggc53
<210>130
<211>54
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>pe2
<400>130
gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctctccaactaccacaaagtcg54
<210>131
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.3g
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(42)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(50)
<223>rna
<400>131
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcagggttaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>132
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.3c
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(42)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(50)
<223>rna
<400>132
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcacccgtaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>133
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.3a
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(42)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(50)
<223>rna
<400>133
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcaaaagtaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>134
<211>78
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.3u
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(42)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(50)
<223>rna
<400>134
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcauuucgtaacgcgttcagtgat60
gcccttgcctacgccacc78
<210>135
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.5
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(44)
<223>rna
<400>135
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcagacguaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>136
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.6s
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(41)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(44)..(45)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(48)..(49)
<223>rna
<400>136
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcagacguaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>137
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.3
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(42)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(48)..(50)
<223>rna
<400>137
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcagacgtaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>138
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.3s
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(40)
<220>
<221>misc_feature
<222>(42)..(42)
<220>
<221>misc_feature
<222>(44)..(44)
<400>138
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcagacguaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>139
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.2
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(41)
<223>rna
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(50)
<223>rna
<400>139
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcagacgtaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>140
<211>77
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>r_kras.7
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(46)
<223>rna
<400>140
agctccaactaccacaaagtcgatagtcacggctactcagacguaacgcgttcagtgatg60
cccttgcctacgccacc77
<210>141
<211>20
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>检测探针（序列锚定探针）
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'alexafluor750
<400>141
tgcgtctatttagtggagcc20
<210>142
<211>9
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>序列文库1st碱基-g
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'磷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(4)
<223>n为任意核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>3'cy3
<400>142
gnnnctatc9
<210>143
<211>20
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>序列文库1st碱基-g
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>3'硫代磷酸
<400>143
ggctccactaaatagacgca20
<210>144
<211>9
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>序列文库1st碱基-a
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'磷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(4)
<223>n为任意核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>3'cy5
<400>144
annnctatc9
<210>145
<211>9
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>序列文库1st碱基-c
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'磷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(4)
<223>n为任意核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>3'texasred
<400>145
cnnnctatc9
<210>146
<211>9
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>序列文库1st碱基-t
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'磷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(4)
<223>n为任意核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>3'alexa488
<400>146
tnnnctatc9
<210>147
<211>9
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>序列文库2nd碱基-g
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'磷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>n为任意核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(4)
<223>n为任意核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>3'cy3
<400>147
ngnnctatc9
<210>148
<211>9
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>序列文库2nd碱基-a
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'磷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>n为任意核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(4)
<223>n为任意核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>3'cy5
<400>148
nannctatc9
<210>149
<211>9
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>序列文库2nd碱基-c
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'磷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>n为任意核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(4)
<223>n为任意核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>3'texasred
<400>149
ncnnctatc9
<210>150
<211>9
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>序列文库2nd碱基-t
<220>
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<223>rna
<400>281
agctccaactaccacaacagacguaacgcgttcagtgatgcccttgcctacgccacc57
1.一种检测样品中靶核酸分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与锁式探针接触并且使所述探针与所述靶核酸分子杂交；
b)使用dna/rna连接酶使所述样品进行连接反应，以连接并从而环化已与所述靶核酸分子杂交的任何探针；
c)通过用dna聚合酶进行滚环扩增以扩增来自步骤(b)的连接的环化探针；以及
d)检测来自步骤(c)的扩增产物，从而检测所述靶核酸序列；
其中所述锁式探针以一个或多个部分提供，每个部分具有至少一个靶标特异性结合位点，所述至少一个靶标特异性结合位点与在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列的同源探针结合位点互补并且与所述靶核酸分子杂交，使得任选地在切割所述杂交探针和/或使用所述靶核酸分子作为模板延伸其3'末端的步骤之后，使用所述靶核酸分子作为连接模板使所述探针或探针部分的可连接末端并置以彼此连接，从而在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列创建连接位点；并且
其中任选地在所述切割和/或延伸步骤之后，所述探针在连接位点处或附近包含至少一个核糖核苷酸，并且所述连接的环化探针主要由dna构成并且包含不超过4个连续核糖核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸序列是靶rna序列，并且其中所述靶核酸分子是靶rna分子。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述探针包含两个或更多个部分，其中创建至少两个连接位点。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述探针在连接位点处的可连接3'末端处或附近包含所述至少一个核糖核苷酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述可连接3'末端通过延伸与所述靶核酸分子杂交的所述探针或其部分的3'末端来创建。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述探针在所述探针或其部分的3'末端处或附近包含所述至少一个核糖核苷酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述探针或其部分的3'末端和/或3'倒数第二个核苷酸是核糖核苷酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述探针在连接位点处的5'可连接末端处不含核糖核苷酸。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述探针或其部分的5'可连接末端通过在所述探针与所述靶分子杂交时切割所述探针来创建。
10.根据权利要求9所述的方法，其中第一靶标特异性靶结合位点位于所述探针或探针部分的5'末端内部并且第二靶标特异性结合位点位于所述探针或探针部分的3'末端处，使得在所述探针或探针部分与所述靶核酸分子杂交后，所述探针或探针部分包含所述第一靶标特异性结合位点的附加序列5'，所述附加序列5'不与所述靶核酸分子杂交并且形成5'活瓣，所述5'活瓣通过切割移除，从而创建5'可连接末端。
11.根据权利要求10所述的方法，其中形成所述5'活瓣的所述附加序列的3'末端处的一个或多个核苷酸与所述靶核酸分子中的同源核苷酸互补，其中所述核苷酸不能和所述探针或探针部分的3'可连接末端同时与所述靶核酸分子杂交。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述附加序列包含一个或多个核糖核苷酸。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述附加序列的3'末端处的一个或多个核苷酸是核糖核苷酸。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述附加序列的最3'核苷酸是核糖核苷酸。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述探针是单一可环化寡核苷酸，其包含在所述探针的5'末端处或内部的第一靶标特异性结合位点和在所述探针的3'末端处的第二靶标特异性结合位点，其中所述第一靶标特异性结合位点和第二靶标特异性结合位点分别形成或构成所述探针的5'可连接末端和3'可连接末端。
16.根据权利要求9至15中任一项所述的方法，其中所述探针是单一可环化寡核苷酸，其包含位于所述探针的5'末端内部的第一靶标特异性靶结合位点和位于所述探针的3'末端处的第二靶标特异性结合位点，使得在所述探针与所述靶核酸分子杂交后，所述探针包含不与所述靶核酸分子杂交的所述第一靶结合位点的附加序列5'，其中所述附加序列的3'末端处的核苷酸是核糖核苷酸，所述核糖核苷酸与所述靶核酸分子中的所述同源核苷酸互补但不能和所述探针的3'可连接末端同时与所述靶核酸分子杂交，其中所述附加序列通过切割移除，从而创建所述探针的5'可连接末端。
17.根据权利要求9至16中任一项所述的方法，其中切割通过具有5'核酸酶活性的酶或通过结构特异性核酸酶进行。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述酶是选自水生栖热菌、嗜热栖热菌或黄色栖热菌聚合酶的dna聚合酶。
19.根据权利要求9至18中任一项所述的方法，其中切割通过flap核酸内切酶进行。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述连接探针包含不超过2个连续核糖核苷酸。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述dna聚合酶是bst聚合酶或phi29dna聚合酶。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述连接酶是t4rna连接酶1、t4rna连接酶2或pbcv-1dna连接酶。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述方法是用于检测靶核酸分子中的变体碱基。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述探针是单一可环化寡核苷酸，其包含位于所述探针的所述5'末端内部的第一靶标特异性结合位点和位于所述探针的3'末端处的第二靶标特异性结合位点，使得在所述探针与所述靶核酸分子杂交后，所述探针包含不与所述靶核酸分子杂交的所述第一靶结合位点的附加序列5'，其中所述探针的3'末端处的核苷酸是核糖核苷酸，并且其中所述探针的3'末端处的核苷酸和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与同一核苷酸互补，其中当所述探针的3'末端处的核苷酸和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与所述变体碱基互补时，所述附加序列的3'末端处的核苷酸不能和所述探针的3'末端同时与所述靶核酸分子杂交，并且所述附加序列通过切割移除，从而产生所述探针的5'可连接末端，并且其中当所述附加序列的3'末端处的核苷酸和所述探针的3'末端处的核苷酸不与所述变体碱基互补时，所述附加序列的3'末端处的核苷酸通过切割移除，并且所述探针的3'末端处的核苷酸不与所述靶核酸分子杂交，从而防止连接。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述探针是单一可环化寡核苷酸，其包含位于所述探针的5'末端内部的第一靶标特异性结合位点和位于所述探针的3'末端处的第二靶标特异性结合位点，使得在所述探针与所述靶核酸分子杂交后，所述探针包含不与所述靶核酸分子杂交的所述第一靶结合位点的附加序列5'，其中所述探针的3'末端处的核苷酸是核糖核苷酸，并且其中所述探针的3'末端处的核苷酸和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与同一核苷酸互补，其中所述探针的3'末端处的核苷酸和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与所述变体碱基的3'位处的核苷酸互补，并且其中所述附加序列的3'末端处的核苷酸不能和所述探针的3'末端同时与所述靶核酸分子杂交，其中当所述第一靶标特异性结合位点的5'末端处的核苷酸与所述变体碱基互补时，所述附加序列通过切割移除，从而产生所述探针的5'可连接末端，并且其中当所述第一靶标特异性结合位点的5'末端处的核苷酸不与所述变体碱基互补时，所述核苷酸也通过切割移除，从而在所述5'可连接末端与3'可连接末端之间产生缺口并且防止连接。
26.一种嵌合dna-rna锁式探针，其能够结合并检测靶核酸分子中的靶核酸序列，其中：
(i)所述探针包括一个或多个部分，每个部分具有至少一个靶标特异性结合位点，所述至少一个靶标特异性结合位点与在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列的同源探针结合位点互补并且与所述靶核酸分子杂交，使得任选地在切割所述杂交探针和/或使用所述靶核酸分子作为模板延伸其3'末端的步骤之后，使用所述靶核酸分子作为连接模板使所述探针或探针部分的可连接末端并置以彼此连接，从而在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列创建一个或多个连接位点，其中所述连接位点处的连接环化所述探针；
(ii)所述探针在连接位点处或附近包含至少一个核糖核苷酸；并且
(iii)所述探针在连接形成环时主要由dna构成并且包含不超过4个连续核糖核苷酸。
27.根据权利要求26所述的嵌合dna-rna锁式探针，其中所述探针是单一可环化寡核苷酸，其包含位于所述探针的5'末端处或内部的第一靶标特异性靶结合位点和位于所述探针的3'末端处的第二靶标特异性结合位点，并且其中：
(i)所述第二靶标特异性结合位点包含一个或多个核糖核苷酸；
(ii)在所述第一靶标特异性结合位点在所述探针的5'末端内部的情况下，所述探针包含所述第一靶标特异性结合位点的附加序列5'，使得当所述探针与所述靶核酸分子杂交时，所述附加序列形成5’活瓣，所述5'活瓣不与所述靶核酸分子杂交，并且可以通过切割移除以产生可连接5'末端，所述可连接5'末端可以连接至所述探针的3'末端以环化所述探针，其中所述附加序列可以任选地含有一个或多个核糖核苷酸；并且
(iii)所述探针在连接形成环时主要由dna构成并且包含不超过4个连续核糖核苷酸。
28.根据权利要求26所述的嵌合dna-rna锁式探针，其中所述探针包括两个或更多个部分，即为主链寡核苷酸的第一部分，其包含位于其5'末端处或内部的第一靶标特异性靶结合位点和位于其3'末端处的第二靶标特异性结合位点；以及一个或多个缺口寡核苷酸，所述一个或多个缺口寡核苷酸各自包含与所述主链寡核苷酸的所述第一靶标特异性靶结合位点与所述第二靶标特异性结合位点之间的所述靶核酸分子互补并且能够与所述靶核酸分子杂交的靶标特异性结合位点，并且其中：
(i)所述主链寡核苷酸的所述第二靶标特异性结合位点和/或至少一个缺口寡核苷酸的所述靶标特异性结合位点处在其3'末端处或附近包含一个或多个核糖核苷酸；
(ii)在所述第一靶标特异性结合位点在所述主链寡核苷酸的5'末端内部的情况下，所述主链寡核苷酸包含所述第一靶标特异性结合位点的附加序列5'，使得当所述主链寡核苷酸与所述靶核酸分子杂交时，所述附加序列形成5'活瓣，所述5'活瓣不与所述靶核酸分子杂交，并且可以通过切割移除以产生可连接5'末端，所述可连接5'末端可以连接至缺口寡核苷酸的3'末端以环化所述探针，其中所述附加序列可以任选地含有一个或多个核糖核苷酸；
(iii)一个或多个缺口寡核苷酸任选地包含所述靶标特异性结合位点的附加序列5'，使得当所述缺口寡核苷酸与所述靶核酸分子杂交时，所述附加序列形成5'活瓣，所述5'活瓣不与所述靶核酸分子杂交，并且可以通过切割移除以产生可连接5'末端，所述可连接5'末端可以连接至另一个缺口寡核苷酸的3'末端或所述主链寡核苷酸的3'末端以环化所述探针，其中所述附加序列可以任选地含有一个或多个核糖核苷酸；并且
(iv)所述主链寡核苷酸和缺口寡核苷酸在连接时形成环，所述环主要由dna构成并且包含不超过4个连续核糖核苷酸。
29.根据权利要求27或28所述的探针，其中所述探针或主链寡核苷酸和/或一个或多个缺口寡核苷酸包含所述第一靶标特异性结合位点或缺口寡核苷酸的靶结合位点的附加序列5'，其中形成5'活瓣的任何附加序列的3'末端处的核苷酸与所述靶核酸分子中与所述探针的3'末端处、或者所述主链寡核苷酸和/或一个或多个缺口寡核苷酸的3'末端处的核苷酸相同的同源核苷酸互补。
30.根据权利要求29所述的探针，其中所述探针是用于检测靶核酸分子中的变体碱基，并且其中：
(i)所述探针或者主链寡核苷酸和/或缺口寡核苷酸的3'末端处的核苷酸和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与变体碱基互补，并且所述附加序列的3'末端处的核苷酸不能和所述探针或者主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸的3'末端处的核苷酸同时与所述靶核酸分子杂交，使得所述附加序列可以通过切割移除以产生所述探针的5'可连接末端；或者
(ii)所述附加序列的3'末端处的核苷酸和所述探针或者主链寡核苷酸和/或缺口寡核苷酸的3'末端处的核苷酸不与所述变体碱基互补，使得所述探针或者主链寡核苷酸和/或缺口寡核苷酸的3'末端处的核苷酸不能与所述靶核酸分子杂交，从而防止连接，并且所述附加序列的3'末端处的核苷酸可以通过切割移除。
31.根据权利要求29所述的探针，其中所述探针是用于检测靶核酸分子中的变体碱基，并且其中：
(i)所述第一靶标特异性结合位点的5'末端处或者主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸的所述靶标特异性结合位点的5'末端处的核苷酸与所述变体碱基互补，所述探针或者主链寡核苷酸和/或缺口寡核苷酸的3'末端处的核苷酸和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与所述变体碱基的3'位处的核苷酸互补，并且所述附加序列的3'末端处的核苷酸不能和所述探针或者主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸的3'末端同时与所述靶核酸分子杂交，使得所述附加序列可以通过切割移除以产生所述探针的5'可连接末端；或者
(ii)所述第一靶标特异性结合位点的5'末端处或者主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸的所述靶标特异性结合位点的5'末端处的核苷酸不与所述变体碱基互补，并且所述核苷酸也通过切割移除，从而在所述5'可连接末端与3'可连接末端之间产生缺口并且防止连接。
32.两个或更多个根据权利要求30或权利要求31所述的探针的探针组，其中所述探针组中的每个探针在与所述变体碱基互补的所述探针和/或主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸和第一靶结合位点或附加序列的3'末端中的位置处包含不同的核苷酸。
33.根据权利要求32所述的探针组，其包含三个或四个探针，其中每个探针在所述位置处包含不同的核苷酸。
34.一种检测样品中靶核酸分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与可连接探针接触并且使所述探针与所述靶核酸分子杂交；
b)使用dna/rna连接酶使所述样品进行连接反应，以连接已与所述靶核酸分子杂交的任何探针；
c)用dna聚合酶扩增来自步骤(b)的连接的探针；并且
d)检测来自步骤(c)的扩增产物，从而检测所述靶核酸序列；
其中每个探针以一个或多个部分提供，每个部分具有至少一个靶标特异性结合位点，所述至少一个靶标特异性结合位点与在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列的同源探针结合位点互补并且与所述靶核酸分子杂交，其中所述探针的一个靶标特异性结合位点或探针部分的至少一个靶标特异性结合位点位于所述探针或探针部分的5'末端内部，使得在所述探针或探针部分与所述靶核酸分子杂交后，所述探针或探针部分包含所述靶标特异性结合位点的附加序列5'，所述附加序列5'不与所述靶核酸分子杂交并且形成5'活瓣，其中所述5'附加序列的3'末端处的一个或多个核苷酸是核糖核苷酸，并且其中在切割所述杂交探针以移除所述5'活瓣的步骤之后，并且任选地在使用所述靶核酸分子作为模板延伸其3'末端的步骤之后，使用所述靶核酸分子作为连接模板，使所述探针或探针部分的可连接末端并置以彼此连接，从而在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列创建连接位点。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述探针包含两个或更多个部分，并且其中创建至少两个连接位点。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中可连接3'末端通过延伸与所述靶核酸分子杂交的所述探针或其部分的3'末端来创建。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中形成所述5'活瓣的所述附加序列的3'末端处的一个或多个核苷酸与所述靶核酸分子中的同源核苷酸互补，其中所述核苷酸不能和所述探针或探针部分的3'可连接末端同时与所述靶核酸分子杂交。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述探针是锁式探针，其包括任选地在延伸步骤之后连接在一起以形成环的一个或多个部分。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述探针是单一可环化寡核苷酸，其包含位于所述探针的5'末端内部的第一靶标特异性结合位点和在所述探针的3'末端处的第二靶标特异性结合位点，其中所述第一靶标特异性结合位点和第二靶标特异性结合位点分别形成或构成所述探针的5'可连接末端和3'可连接末端。
40.根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述探针是单一可环化寡核苷酸，其包含位于所述探针的5'末端内部的第一靶标特异性结合位点和位于所述探针的3'末端处的第二靶标特异性结合位点，使得在所述探针与所述靶核酸分子杂交后，所述附加序列的3'末端处的核苷酸与所述靶核酸分子中的所述同源核苷酸互补但不能和所述探针的3'可连接末端同时与所述靶核酸分子杂交。
41.根据权利要求34至40中任一项所述的方法，其中切割通过具有5'核酸酶活性的酶或通过结构特异性核酸酶进行。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述酶是选自水生栖热菌、嗜热栖热菌或黄色栖热菌聚合酶的dna聚合酶。
43.根据权利要求34至40中任一项所述的方法，其中切割通过flap核酸内切酶进行。
44.根据权利要求34至43中任一项所述的方法，其中所述连接探针包含不超过4个连续核糖核苷酸，优选地其中所述连接探针包含不超过3个、或不超过2个连续核糖核苷酸。
45.根据权利要求34至44中任一项所述的方法，其中所述连接探针在连接位点处或附近不含核糖核苷酸。
46.根据权利要求34至45中任一项所述的方法，其中在所述探针通过连接环化的情况下，所述扩增是滚环扩增。
47.根据权利要求34至46中任一项所述的方法，其中扩增是pcr或其变型、sda、hda、lamp或smap。
48.根据权利要求34至47中任一项所述的方法，其中所述dna聚合酶是bst聚合酶或phi29dna聚合酶。
49.根据权利要求34至48中任一项所述的方法，其中所述连接酶是t4rna连接酶1、t4rna连接酶2或pbcv-1dna连接酶。
50.根据权利要求34至49中任一项所述的方法，其中所述方法是用于检测靶核酸分子中的变体碱基。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述探针是单一可环化寡核苷酸，其包含位于所述探针的5'末端内部的第一靶标特异性结合位点和位于所述探针的3'末端处的第二靶标特异性结合位点，其中所述探针的3'末端处和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与同一核苷酸互补，其中当所述探针的3'末端处的核苷酸和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与变体碱基互补时，所述附加序列的3'末端处的核苷酸不能和所述探针的3'末端处的核苷酸同时与所述靶核酸分子杂交，并且所述附加序列通过切割移除，从而产生所述探针的5'可连接末端，并且其中当所述附加序列的3'末端处的核苷酸和所述探针的3'末端处的核苷酸不与所述变体碱基互补时，所述附加序列的3'末端处的核苷酸通过切割移除，并且所述探针的3'末端处的核苷酸不与所述靶核酸分子杂交，从而防止连接。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述探针是单一可环化寡核苷酸，其包含位于所述探针的5'末端内部的第一靶标特异性结合位点和位于所述探针的3'末端处的第二靶标特异性结合位点，其中所述探针的3'末端处的核苷酸和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与同一核苷酸互补，其中所述探针的3'末端处的核苷酸和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与所述变体碱基的3'位处的核苷酸互补，并且其中所述附加序列的3'末端处的核苷酸不能和所述探针的3'末端处的核苷酸同时与所述靶核酸分子杂交，其中当所述第一靶标特异性结合位点的5'末端处的核苷酸与所述变体碱基互补时，通过所述附加序列切割移除，从而产生所述探针的5'可连接末端，并且其中当所述第一靶标特异性结合位点的5'末端处的核苷酸不与所述变体碱基互补时，所述核苷酸也通过切割移除，从而在所述5'可连接末端与3'可连接末端之间产生缺口并且防止连接。
53.一种嵌合dna-rna探针，其能够结合并且检测靶核酸分子中的靶核酸序列，其中所述探针包括一个或多个部分，每个部分具有至少一个靶标特异性结合位点，所述至少一个靶标特异性结合位点与在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列的同源探针结合位点互补并且与其杂交，其中所述探针的一个靶标特异性结合位点或探针部分的至少一个靶标特异性结合位点位于所述探针或探针部分的5'末端内部，使得在所述探针或探针部分与所述靶核酸分子杂交后，所述探针或探针部分包含所述靶标特异性结合位点的附加序列5'，所述附加序列5'不与所述靶核酸分子杂交并且形成5'活瓣，其中所述5'附加序列的3'末端处的一个或多个核苷酸是核糖核苷酸，并且其中在切割所述杂交探针以移除所述5'活瓣的步骤之后，并且任选地在使用所述靶核酸分子作为模板延伸所述探针或探针部分的3'末端的步骤之后，使用所述靶核酸分子作为连接模板，使所述探针或探针部分的可连接末端并置以彼此连接，从而在所述靶核酸序列处或相邻于所述靶核酸序列创建连接位点。
54.根据权利要求53所述的嵌合dna-rna探针，其中所述探针是锁式探针，其中所述探针与所述靶核酸分子杂交，使得在切割所述附加序列之后并且任选地在使用所述靶核酸分子作为模板延伸所述探针或探针部分的3'末端的步骤之后，使用所述靶核酸分子作为连接模板使所述探针或探针部分的可连接末端并置以彼此连接，以在所述靶核酸分子处或相邻于所述靶核酸分子创建一个或多个连接位点，并且其中所述连接位点处的连接环化所述探针。
55.根据权利要求54所述的嵌合dna-rna探针，其中所述探针是单一可环化寡核苷酸，其包含位于所述探针的5'末端内部的第一靶标特异性靶结合位点和位于所述探针的3'末端处的第二靶标特异性结合位点。
56.根据权利要求55所述的嵌合dna-rna探针，其中所述探针包括两个或更多个部分，即为主链寡核苷酸的第一部分，其包含位于其5'末端内部的第一靶标特异性靶结合位点和位于其3'末端处的第二靶标特异性结合位点；以及一个或多个缺口寡核苷酸，所述一个或多个缺口寡核苷酸各自包含与所述主链寡核苷酸的所述第一靶标特异性结合位点与所述第二靶标特异性结合位点之间的所述靶核酸分子互补并且能够与所述靶核酸分子杂交的靶标特异性结合位点，并且其中一个或多个缺口寡核苷酸任选地包含至述靶标特异性结合位点的附加序列5'，使得当所述缺口寡核苷酸与所述靶核酸分子杂交时，所述附加序列形成5'活瓣，所述5'活瓣不与所述靶核酸分子杂交，并且可以通过切割移除以产生可连接5'末端，所述可连接5'末端可以连接至另一个缺口寡核苷酸的3'末端或所述主链寡核苷酸的3'末端以环化所述探针，其中所述附加序列可以任选地含有一个或多个核糖核苷酸。
57.根据权利要求53至56中任一项所述的嵌合dna-rna探针，其中形成5'活瓣的任何附加序列的3'末端处的核苷酸与所述靶核酸分子中与所述探针的3'末端处或者所述主链寡核苷酸和/或一个或多个缺口寡核苷酸的3'末端处的核苷酸相同的同源核苷酸互补。
58.根据权利要求57所述的探针，其中所述探针是用于检测靶核酸分子中的变体碱基，并且其中：
(i)所述探针或探针部分或主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸的3'末端处的核苷酸和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与变体碱基互补，并且所述附加序列的3'末端处的核苷酸不能和所述探针或探针部分或者主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸的3'末端同时与所述靶核酸分子杂交，使得所述附加序列可以通过切割移除以产生所述探针的5'可连接末端；或者
(ii)所述探针或探针部分或者主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸的3'末端处的核苷酸和所述附加序列的3'末端处的核苷酸不与所述变体碱基互补，使得所述探针或探针部分或者主链寡核苷酸和/或缺口寡核苷酸的3'末端处的核苷酸不能与所述靶核酸分子杂交，从而防止连接，并且所述附加序列的3'末端处的核苷酸还可以通过切割移除。
59.根据权利要求57所述的探针，其中所述探针是用于检测靶核酸分子中的变体碱基，并且其中：
(i)所述第一靶标特异性结合位点的5'末端处或探针部分或者主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸的所述靶标特异性结合位点的5'末端处的核苷酸与所述变体碱基互补，所述探针或探针部分或者主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸的3'末端处的核苷酸和所述附加序列的3'末端处的核苷酸与所述变体碱基的所述位置3'处的核苷酸互补，并且所述附加序列的3'末端处的核苷酸不能和所述探针或者主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸的3'末端同时与所述靶核酸分子杂交，使得所述附加序列可以通过切割移除以产生所述探针的5'可连接末端；或者
(ii)所述第一靶标特异性结合位点的5'末端处或探针部分或者主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸的所述靶标特异性结合位点的5'末端处的核苷酸不与所述变体碱基互补，并且所述核苷酸也通过切割移除，从而在所述5'可连接末端与3'可连接末端之间产生缺口并且防止连接。
60.一组两个或更多个根据权利要求58或59所述的探针的探针组，其中所述组中的每个探针在与所述变体碱基互补的所述探针或探针部分或者主链寡核苷酸或缺口寡核苷酸和第一靶结合位点或附加序列的3'末端中的位置处包含不同的核苷酸。
61.根据权利要求60所述的探针组，其包含三个或四个探针，其中每个探针在所述位置处包含不同的核苷酸。
62.一种通过滚环扩增合成dna分子的方法，所述方法包括使包含至少一个核糖核苷酸且不超过四个连续核糖核苷酸的环状模板核酸分子与phi29dna聚合酶接触，并且产生dna分子，所述dna分子包含所述模板核酸分子的反向补体序列的多个串联重复序列，其中所述phi29dna聚合酶的序列尚未被修饰以增加rt活性。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述模板核酸分子包含不超过3个连续核糖核苷酸。
64.根据权利要求62或63所述的方法，其中所述模板核酸分子包含不超过2个连续核糖核苷酸。
65.根据权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述模板核酸分子包含2个或更多个连续核糖核苷酸。
66.根据权利要求62至65中任一项所述的方法，其中所述模板核酸分子包含一个或多个单一核糖核苷酸。
67.根据权利要求62至66中任一项所述的方法，其中所述模板核酸分子在所述模板核酸分子内的单一位点内包含核糖核苷酸。
68.根据权利要求62至67中任一项所述的方法，其中所述模板核酸分子包含1个核糖核苷酸。
69.根据权利要求62至66中任一项所述的方法，其中所述模板核酸分子在两个或更多个分开的位点处含有核糖核苷酸，并且在每个位点之间包含一个或多个脱氧核糖核苷酸。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述模板核酸分子在两个或更多个分开的位点处含有核糖核苷酸，其中两个位点通过单一脱氧核糖核苷酸分开。
71.根据权利要求65所述的方法，其中所述连续核糖核苷酸是同种型的。
72.根据权利要求62至70中任一项所述的方法，其中所述核糖核苷酸中的至少一个是嘧啶核糖核苷酸，或根据权利要求71所述的方法，其中所述连续核糖核苷酸是嘧啶核糖核苷酸。
73.根据权利要求69或70所述的方法，其中每个位点含有根据权利要求63至66或71中任一项所述的核糖核苷酸。
74.根据权利要求62至73中任一项所述的方法，其中所述核糖核苷酸不是核糖核苷酸的化学修饰物、类似物或衍生物。
75.根据权利要求62至74中任一项所述的方法，其中所述环状核酸分子是在使用靶核酸分子作为模板连接以一个或多个部分提供的锁式探针之后形成的，其中所述连接包括连接探针或探针部分的可连接末端以创建连接位点。
76.phi29dna聚合酶作为逆转录酶的用途，其中所述phi29聚合酶的序列尚未被修饰以增加rt活性。
技术总结